強心甙類藥物誘導人非小細胞型肺癌細胞自噬機制研究.pdf

1、強心甙類藥物能與真核細胞膜鈉鉀ATP酶(Na+/K+-ATPase)特異性結(jié)合，抑制該酶的活性，因此多年來被用于充血性心力衰竭和心律失常的治療。越來越多的研究表明Na+/K+-ATPase抑制劑對多種器官組織來源的腫瘤有較好的抑制活性，但其作用機制并未得到全面深入的闡釋。肺癌是當今世界發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一，而非小細胞肺癌(NSCLC)則約占肺癌發(fā)病的80％。在本研究中，我們以植物來源的地高辛和哇巴因作為代表性的強心甙類藥物，

2、采用人非小細胞型肺癌細胞作為強心甙類藥物的作用對象，主要在A549和H460細胞中進行研究，探討地高辛或哇巴因誘導人非小細胞肺癌細胞自噬發(fā)生的條件及其相關信號通路變化，并研究自噬與藥物引起的抗腫瘤活性之間的關系。
　　 首先我們采用MTT法檢測兩種藥物分別對腫瘤細胞的生長抑制作用，發(fā)現(xiàn)該類藥物在納摩爾水平就能有效地抑制多種人非小細胞肺癌細胞系生長，且其抗腫瘤活性是順鉑的104倍。熒光定量PCR檢測Na+/K+-ATPaseα3與

3、α1亞基基因表達，發(fā)現(xiàn)α3/α1比值可能與強心甙類藥物的抗腫瘤活性相關。我們在半數(shù)抑制濃度(IC50)范圍進行下一步機制研究。流式細胞術發(fā)現(xiàn)兩種藥物在該濃度下，引起A549或H460細胞部分G2/M期阻滯；除哇巴因處理的H460組Sub-G1的細胞比例約占13.2％外，兩種藥物誘導的Sub-G1比例均在5％以下。同時，Hoechst33342染色觀察到的細胞核型變化和westernblotting檢測凋亡標志蛋白PARP的結(jié)果均說明在此

4、濃度下，該類藥物較少引起細胞凋亡。
　　 進一步的研究采用PBS饑餓作為自噬的陽性對照組，發(fā)現(xiàn)強心甙類藥物處理與饑餓組出現(xiàn)相似的自噬相關表型變化。在地高辛或哇巴因短時間作用下，westernblotting檢測到自噬標志蛋白LC3-Ⅱ表達顯著升高，自噬相關蛋白Atg5/12復合物和Beclin1的表達也明顯增加；利用吖啶橙染色觀察到細胞胞質(zhì)中出現(xiàn)酸性空泡；電子透射顯微鏡檢測到胞質(zhì)中自噬體和自噬空泡的形成，并通過熒光顯微鏡捕捉到G

5、FP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)出現(xiàn)的點狀凝集現(xiàn)象，其中地高辛或哇巴因作用A549細胞后GFP-LC3陽性細胞分別約占17.3％或16.0％，陽性率較正常對照組顯著增加(P＜0.01)。機制研究顯示該類藥物通過上調(diào)AMPK活性以及TSC2蛋白表達水平，有效地抑制mTOR信號通路，尤其對mTOR下游分子4E-BP1的抑制作用強于S6K1，而mTOR的另一個上游分子Akt的活性在藥物處理后沒有明顯變化。此外，本研究結(jié)果顯示強心甙類藥物能夠激活由

6、Src介導MEK1/2/ERK1/2信號通路，該通路對藥物誘導的細胞自噬起著正調(diào)節(jié)作用。我們給予自噬抑制劑或是對信號通路相關蛋白進行siRNA干擾發(fā)現(xiàn)，這些干預手段可顯著逆轉(zhuǎn)藥物誘導的細胞自噬表型包括LC3-Ⅱ表達降低、GFP-LC3點狀凝集細胞數(shù)減少以及信號通路變化。同時研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)自噬表型的逆轉(zhuǎn)導致藥物抗腫瘤活性降低，提示藥物誘導的自噬發(fā)揮著抗腫瘤作用。此外，我們初步研究了強心甙類藥物激活的激酶通路之間的相互關系，發(fā)現(xiàn)Src蛋白處于

7、AMPK上游，介導了藥物誘導的AMPK活化，而ERK1/2激酶則處于AMPK下游。
　　 綜上所述，強心甙類藥物對人非小細胞肺癌細胞系具有顯著的抗腫瘤活性，在IC50濃度范圍，該類藥物一方面誘導細胞發(fā)生周期阻滯；另一方面通過調(diào)節(jié)AMPK/mTOR和Src/ERK1/2雙重信號通路誘導人非小細胞型肺癌細胞發(fā)生自噬，這種自噬作用至少部分解釋了藥物的抗腫瘤活性。本研究從另一新穎角度深入闡釋了靶向Na+/K+-ATPase的強心甙類藥物