自噬對(duì)非小細(xì)胞肺癌EGFR-TKI耐藥的調(diào)控作用及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分自噬與非小細(xì)胞肺癌EGFR-TKI耐藥的關(guān)系
　　目的：構(gòu)建EGFR-TKI耐藥細(xì)胞株并探索EGFR-TKI耐藥與自噬活動(dòng)的關(guān)系。
　　方法：選取4種NSCLC細(xì)胞系HCC827，A549，H460和H1975,進(jìn)行基因檢測(cè)以驗(yàn)證其EGFR突變狀態(tài)，并通過(guò)CCK8測(cè)定其對(duì)erlotinib的敏感性。以EGFR-TKI敏感細(xì)胞HCC827為基礎(chǔ),通過(guò)長(zhǎng)期且濃度遞增的erlotinib處理以誘導(dǎo)出EGFR-TKI耐藥細(xì)胞

2、株，并通過(guò)CCK8鑒定其對(duì)erlotinib的敏感性，命名為HCC827-R。通過(guò)Western blotting檢測(cè)HCC827，A549，H460，H1975和HCC827-R5種細(xì)胞的基礎(chǔ)自噬水平，并通過(guò)GFP-LC3和CQ(chloroquine)進(jìn)一步驗(yàn)證HCC827和HCC827-R的自噬流水平。通過(guò)抑制劑（CQ或3-MA）或siRNA抑制基礎(chǔ)自噬觀察其對(duì)細(xì)胞增殖的影響。
　　結(jié)果：EGFR基因檢測(cè)結(jié)果為：HCC827

3、(E746- A750 deletion), A549(wild type), H460(wild type), H1975(L858R and T790M),通過(guò)CCK8藥物敏感性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HCC827對(duì)erlotinib敏感，而A549, H460, H1975和HCC827-R對(duì)erlotinib抗拒，其中HCC827-R對(duì)erlotinib的IC50值大于100μM。綜合比較HCC827, A549, H460, H1975和HC

4、C827-R的EGFR-TKI敏感性和基礎(chǔ)自噬水平發(fā)現(xiàn)，從HCC827到HCC827-R，細(xì)胞對(duì)erlotinib的藥物敏感性逐漸降低，而 LC3-II水平，即基礎(chǔ)自噬水平逐漸增高。通過(guò) GFP-LC3和CQ的介入進(jìn)一步證實(shí)，HCC827-R的基礎(chǔ)自噬流水平明顯高于HCC827。以3-MA或siRNA抑制基礎(chǔ)自噬后，HCC827和HCC827-R的增殖未受明顯影響。
　　結(jié)論：相對(duì)于 EGFR-TKI敏感細(xì)胞，EGFR-TKI耐藥

5、細(xì)胞擁有更高的基礎(chǔ)自噬水平，對(duì)EGFR-TKI的敏感性與細(xì)胞基礎(chǔ)自噬水平之間存在負(fù)相關(guān)性，基礎(chǔ)自噬活動(dòng)不是細(xì)胞增殖的必需因素。
　　第二部分自噬對(duì)非小細(xì)胞肺癌EGFR-TKI耐藥的調(diào)控作用
　　目的：進(jìn)一步探索自噬在 NSCLC細(xì)胞對(duì) EGFR-TKI耐藥中的作用以及抑制自噬對(duì)EGFR-TKI耐藥的影響。
　　方法：通過(guò)不同時(shí)間不同濃度的erlotinib處理HCC827, A549, H1975和HCC827-R細(xì)胞

6、，觀察erlotinib對(duì)細(xì)胞自噬活動(dòng)的影響。將自噬抑制劑（CQ或3-MA）與erlotinib聯(lián)合應(yīng)用于HCC827, A549, H1975和HCC827-R細(xì)胞，觀察二者的聯(lián)合作用對(duì)自噬活動(dòng)以及細(xì)胞增殖的影響。通過(guò) Annexin V和 PI雙染檢測(cè)不同濃度的CQ或 CQ與erlotinib聯(lián)用對(duì)H1975或HCC827-R凋亡活動(dòng)的影響，并以Western blotting進(jìn)一步觀察PARP1和caspase3的變化。在CQ和e

7、rlotinib聯(lián)合作用下，以JC-1染色觀察線粒體膜電位的變化，并分別提取胞漿和線粒體蛋白以Western blotting檢測(cè)胞漿和線粒體中cytochrome c的含量。
　　結(jié)果：Erlotinib呈時(shí)間依賴性的誘導(dǎo)HCC827, A549, H1975和HCC827-R細(xì)胞自噬水平升高，而這一作用可以被自噬抑制劑3-MA或CQ阻斷。3-MA或CQ均與erlotinib表現(xiàn)出協(xié)同作用，抑制了HCC827, A549, H1

8、975和HCC827-R的細(xì)胞增殖，其中3-MA單藥對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯的抑制作用，而CQ單藥使用時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)和克隆形成均受到顯著抑制，提示作用于不同靶點(diǎn)的自噬抑制劑對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖具有不同的影響。CQ與erlotinib聯(lián)合作用引起了H1975和HCC827-R凋亡水平增高，激活了PARP1與caspase3，而caspase抑制劑z-VAD fmk逆轉(zhuǎn)了這一聯(lián)合作用引起的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制。此外，CQ與 erlotinib聯(lián)合應(yīng)用還引起了線

9、粒體膜電位的丟失和線粒體膜通透性的降低，表現(xiàn)為cytochrome c從線粒體釋放入胞漿。
　　結(jié)論：自噬抑制劑（3-MA或 CQ）抑制了 EGFR-TKI引起的自噬反應(yīng)并進(jìn)而逆轉(zhuǎn)了NSCLC細(xì)胞對(duì)EGFR-TKI的耐藥，CQ與erlotinib的聯(lián)合應(yīng)用通過(guò)降低線粒體的膜電位和膜通透性引起NSCLC細(xì)胞發(fā)生caspase依賴性的凋亡反應(yīng)。
　　第三部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在CQ逆轉(zhuǎn)EGFR-TKI耐藥中的作用及機(jī)制
　　目的：

10、觀察線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)活動(dòng)在CQ逆轉(zhuǎn)EGFR-TKI耐藥中的作用。
　　方法：通過(guò)GFP-LC3與線粒體示蹤劑mitotracker的共定位情況觀察線粒體自噬是否參與了CQ與erlotinib的聯(lián)合作用。在CQ與erlotinib的聯(lián)合作用下以Western blotting檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路蛋白EIF2α-CHOP的水平，并通過(guò)siRNA靶向敲除CHOP觀察其對(duì)H1975細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖的影響。進(jìn)而，通過(guò)JC-1染色和Wester

11、n blotting檢測(cè)靶向敲除CHOP后CQ與erlotinib聯(lián)合作用下線粒體膜電位和膜通透性變化。最后，通過(guò)建立H1975移植瘤模型，檢測(cè)CQ與erlotinib聯(lián)合作用對(duì)H1975移植瘤增殖的影響。
　　結(jié)果：在CQ與erlotinib聯(lián)合作用下，GFP-LC3未能與mitotracker形成熒光共定位，說(shuō)明線粒體自噬未參與CQ與erlotinib的聯(lián)合作用。通過(guò)Western blotting發(fā)現(xiàn)CQ與erlotinib

12、聯(lián)合作用引起了EIF2α-CHOP通路的活化，說(shuō)明其引起了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。對(duì)CHOP的敲除，逆轉(zhuǎn)了CQ與erlotinib聯(lián)合作用引起的凋亡反應(yīng)和細(xì)胞生長(zhǎng)抑制，并且抑制了線粒體膜電位和膜通透性的變化。在體內(nèi)試驗(yàn)中，CQ與 erlotinib聯(lián)合作用顯著抑制了H1975移植瘤的生長(zhǎng)。
　　結(jié)論：CQ與erlotinib聯(lián)合作用通過(guò)介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)而引起線粒體膜電位和通透性的變化，最終引起凋亡，其中CHOP起到了凋亡信號(hào)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)