黃連素誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞自噬與凋亡及分子機(jī)制研究.pdf

1、肝癌在惡性腫瘤中占六分之一，且因極差的預(yù)后成為世界上第三大死亡原因。而目前化學(xué)治療的結(jié)果不能令人滿意，從具有抗癌活性的中(植物)藥中提取、純化有效的抗腫瘤成分，成為世界醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。
　　黃連素是一種異喹啉類(lèi)的生物堿，它在眾多藥用植物種屬中占有很重要的地位。近來(lái)人們研究發(fā)現(xiàn)黃連素有抗腫瘤的作用，并通過(guò)不同機(jī)制在體內(nèi)和體外發(fā)揮其抗癌性。大量的實(shí)驗(yàn)證實(shí)黃連素有抗腫瘤的作用是在對(duì)很多腫瘤細(xì)胞本身的影響上，主要是通過(guò)抑制細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)

2、細(xì)胞凋亡以及阻止細(xì)胞周期的方式。還有研究報(bào)道黃連素在體內(nèi)可以輔助化療藥物降低副作用以抗腫瘤。由于黃連素取自黃連的干燥根莖，且在中醫(yī)看來(lái)黃連歸肝、胃、小腸經(jīng)，瀉火解毒作用極強(qiáng)，與其他同類(lèi)藥用植物比偏于治療中焦，而肝臟則位于中焦，肝癌為“肥氣”，因此，我國(guó)臨床上治療肝癌常有以黃連為君藥的三黃湯及黃連解毒湯等的報(bào)道。這給了我們一個(gè)新的思路，用黃連提取物來(lái)研究對(duì)肝癌的影響是否能有新發(fā)現(xiàn)，而其機(jī)制也仍然需要我們進(jìn)一步闡明。
　　CD147，

3、一種糖化免疫球蛋白中在肝癌內(nèi)具高表達(dá)的超蛋白，已被確定為有前途的治療癌癥化療的參考指標(biāo)。體外研究表明，CD147可促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及血管新生，抑制細(xì)胞凋亡和壞死并賦予癌細(xì)胞抵抗某些化療的耐藥性。最近的一項(xiàng)研究表明，CD147在肝癌中的細(xì)胞自噬和自噬性細(xì)胞死亡的抑制性調(diào)節(jié)中起了重要作用。然而，CD147是否參與黃連素抗腫瘤作用未見(jiàn)報(bào)道。因此，本課題擬研究黃連素是否誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的死亡以及黃連素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞死亡的分子機(jī)制，即CD147分子是

4、否參與調(diào)節(jié)黃連素誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。
　　我們采用不同濃度的黃連素誘導(dǎo)兩種人肝癌細(xì)胞HepG2和SMMC7721，發(fā)現(xiàn)其出現(xiàn)自噬性死亡和凋亡,并從黃連素對(duì)CD147的作用方面探討了自噬與凋亡的可能機(jī)制。自噬性細(xì)胞死亡是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的另一型程序性細(xì)胞死亡方式。當(dāng)細(xì)胞處于如饑餓、乏氧等惡劣環(huán)境時(shí)，可通過(guò)適度的自噬降解自身產(chǎn)物滿足生存基本物質(zhì)與能量需求；但過(guò)度自噬又將導(dǎo)致細(xì)胞自噬性死亡。新近有研究證實(shí)，腫瘤在無(wú)血管新生成之前期，乏氧腫瘤的環(huán)

5、境亦可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生自噬；黃連素可以通過(guò)Rho/ROCK途徑來(lái)抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)。這些都為我們研究抗腫瘤藥物提供了新方向，即觀察藥物是否能促使腫瘤細(xì)胞引起自噬，以及是否能導(dǎo)致細(xì)胞最終發(fā)生自噬性死亡。
　　本實(shí)驗(yàn)分為三部分：
　　第一部分：黃連素抑制肝癌細(xì)胞細(xì)胞活性的時(shí)間依賴(lài)性和劑量依賴(lài)性的研究
　　選取兩種肝癌細(xì)胞（HepG2、SMMC7721），采用MTT法證實(shí)黃連素對(duì)兩種肝癌細(xì)胞均具有細(xì)胞毒性作用。然后分別用0,3

6、1.25,62.5,125,250和500μM的不同濃度黃連素對(duì)HepG2和SMMC7721肝癌細(xì)胞處理24h，采用MTT法檢測(cè)不同濃度下的肝癌細(xì)胞的活性變化。根據(jù)上述檢測(cè)結(jié)果選取含有62.5μM濃度的黃連素的培養(yǎng)液分別處理兩種肝癌細(xì)胞，在0，24，48，72和96h后，采用MTT檢測(cè)不同時(shí)間肝癌細(xì)胞的活性變化。結(jié)果表明，黃連素對(duì)HepG2和SMMC7721肝癌細(xì)胞在濃度為0,31.25,62.5125,250,500μM及62.5μM

7、濃度下培養(yǎng)0,24,48,72,96h后具顯著的時(shí)間依賴(lài)性和劑量依賴(lài)性。
　　第二部分：黃連素誘導(dǎo)兩種肝癌細(xì)胞自噬和凋亡的研究
　　本實(shí)驗(yàn)分兩個(gè)步驟：首先，運(yùn)用熒光技術(shù)檢測(cè)黃連素是否誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬以及用透射電子顯微鏡（TEM）檢測(cè)自噬。1）我們選用SMMC7721肝癌細(xì)胞作為研究黃連素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬的細(xì)胞模型。將pEGFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到SMMC7721肝癌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染成功后，將細(xì)胞分為六個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別用0,31.25,

8、62.5,125,250，500μM的黃連素培養(yǎng)24h，用熒光顯微鏡觀察綠色的EGFP-LC3點(diǎn)狀陽(yáng)性細(xì)胞以證明黃連素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生自噬。研究表明，黃連素這種誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬的現(xiàn)象是存在的，而且是劑量依賴(lài)性的；2）將SMMC7721和HepG2兩種肝癌細(xì)胞分為對(duì)照組和黃連素處理組，采用0μM和500μM黃連素培養(yǎng)兩種細(xì)胞24h，分別收集細(xì)胞，用透射電子顯微鏡檢測(cè)自噬的特異性標(biāo)志物—自噬泡的形成，結(jié)果顯示：在黃連素處理組，發(fā)現(xiàn)大量自噬泡

9、和凋亡小體共同存在，表明黃連素不僅誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生了自噬而且誘導(dǎo)其發(fā)生了凋亡。接下來(lái)為了證明黃連素可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬性細(xì)胞死亡和凋亡，我們分別使用自噬特異性抑制劑3-methyladenine（3-MA）和凋亡的抑制劑z-DEVD-fmk，同時(shí)使用不增加抑制劑的對(duì)照，采用臺(tái)盼蘭染色的方法，計(jì)算細(xì)胞的死亡率。研究發(fā)現(xiàn)，這兩種抑制劑都可以分別有效抑制黃連素誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。這進(jìn)一步證明了黃連素既可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的自噬性細(xì)胞死亡，又可以誘導(dǎo)肝

10、癌細(xì)胞的凋亡。
　　第三部分：黃連素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬性死亡與凋亡的分子機(jī)制
　　已有的研究表明CD147在SMMC7721細(xì)胞中可以抑制饑餓誘導(dǎo)的自噬性細(xì)胞死亡，黃連素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬性死亡與凋亡是否通過(guò)CD147的表達(dá)途經(jīng)有待證實(shí)。實(shí)驗(yàn)分兩個(gè)步驟：第一：通過(guò)WesternBlot方法檢測(cè)HepG2、SMMC7721肝癌細(xì)胞在不同濃度黃連素的作用下CD147分子的表達(dá)變化。結(jié)果表明隨著黃連素濃度的提高，CD147表達(dá)呈明顯降