骨髓源性肝干細胞的篩選、擴增及誘導分化的研究肝癌術后肝再生狀態(tài)與肝癌復發(fā)關系的初步研究.pdf

1、本文共分兩部分：第一部分，骨髓源性肝干細胞的篩選、擴增及誘導分化的研究摘要肝炎、肝硬化及肝癌等肝臟疾病所致的終末性肝功能障礙，目前最有效的治療手段是原位肝移植(OLT)。然而，由于供體匱乏、免疫排斥和高額費用等問題，原位肝移植的廣泛應用受到了限制。肝細胞移植(HTx)和生物人工肝技術(BAL)是目前建立的替代治療方式。與OLT相比，HTx和BAL具有操作簡單、可重復進行、供肝細胞免疫源性較低且可凍存、移植失敗或產生免疫排斥對受體影響小、

2、治療費用低等優(yōu)點。理論上來講，HTx和BAL在許多方面已經具有代替原位肝移植的潛在優(yōu)勢，但事實上，HTx和BAL的臨床應用遠未達到理論上的預期效果，存在一些亟待解決的問題，其中肝細胞來源缺乏是制約這兩種治療方式發(fā)展的重要因素。目前的研究方向有永生化肝細胞和肝干細胞。由于永生化肝細胞是由病毒致癌原轉染而來，對機體有許多不確定的影響，目前尚未能對其應用進行評估。而干細胞由于具有自我更新、高度增殖和多向分化的潛能，為肝細胞移植及生物人工肝技術

3、展示出誘人的前景。 肝干細胞的供源研究有肝源性的的肝干細胞(LSC)或肝祖細胞(HPC)以及非肝源性肝干細胞，前者包括卵圓細胞和小肝細胞，后者包括胚胎干細胞(ESC)、胰源性肝干細胞(PDLSC)和骨髓源性肝干細胞(BDLSC)。這些干細胞源，均已證實具有向肝實質細胞分化的潛能，但各有其優(yōu)缺點。從細胞特征、供體來源以及分離培養(yǎng)的特點等方面看，BDLSC具有易于調控、供源豐富、容易獲得、可從自體獲取、避免免疫排斥等優(yōu)點，是較為理想

4、的肝干細胞來源。 BDLSC的研究，目前只是證實了它的存在以及轉化能力，還不能進入應用研究階段，原因之一在于骨髓內的細胞群體非常復雜，至今尚未發(fā)現(xiàn)可直接鑒定BDLSC的特征性表面標志，其在骨髓干細胞衍生過程中的具體譜系定位也不清楚，以至對其的分離純化存在困難。目前鑒別BDLSC的研究方法，需要分析新的原始細胞標志或者新的干細胞群體，盡管有利于對骨髓內細胞群體的精確劃分，卻導致了對肝干細胞識別和分離的困難，而且實用性不強。

5、 鑒于成體干細胞的增殖需要環(huán)境刺激的特征，肝干細胞的增殖需要肝再生的微環(huán)境，而我們的前期工作發(fā)現(xiàn)適合肝干細胞增殖的肝損傷病理微環(huán)境是其它骨髓細胞類型所不能適應的，由此本課題設想采用適者生存的原理，建立一套病理微環(huán)境的體外篩選培養(yǎng)體系，在這一培養(yǎng)體系中，只有適應這一環(huán)境的肝干細胞可以生存增殖，而其它類型的細胞則逐漸凋亡，從而達到從骨髓細胞的體外培養(yǎng)中直接篩選和擴增肝干細胞的目的，并進行體內外誘導分化，探討臨床應用的可行性。 結論：

6、1.大鼠篩選培養(yǎng)液以含5％淤膽血清的最佳，一方面可以使適應該病理微環(huán)境的BDLSC能夠生長分化，另一方面使不能適應的非肝干細胞凋亡，達到篩選與純化的目的。擴增培養(yǎng)體系可以將純化的肝干細胞培養(yǎng)傳代至8代，8代以后細胞出現(xiàn)纖維樣細胞的增生。流式細胞儀檢測肝干細胞表面標志，各代細胞穩(wěn)定表達各干細胞標志，說明傳代的穩(wěn)定性。分化的細胞具有肝細胞樣表型和功能：表達白蛋白、AFP、CK8/18；有肝細胞特征蛋白的mRNA轉錄；呈現(xiàn)與肝細胞相似的超微結

7、構；具有糖原和尿素合成的功能；經門靜脈及經脾移植均可整合入肝板，脾臟內也可見肝細胞樣細胞的增殖。 2.人骨髓肝干細胞的篩選采用急性肝功能不全的血清，TBIL在150μmol/L～300μmol/L，HGF濃度在10～20ng/ml，以5％濃度加入基礎培養(yǎng)液篩選效果最為理想。擴增培養(yǎng)液可將肝干細胞傳代達5代。流式細胞儀檢測肝干細胞的表面標志與肝卵圓細胞的標志相似。分化細胞具有肝細胞樣的表型和功能：免疫熒光表達白蛋白；有肝細胞特征性

8、蛋白的mRNA轉錄；Westernblot檢測分化前后白蛋白、AFP表達有差異，分化前白蛋白低表達、AFP高表達，分化后則相反；分化細胞具有尿素及白蛋白合成功能。 [結論]1.含淤膽血清的病理篩選培養(yǎng)體系可以篩選、純化大鼠骨髓肝干細胞，擴增培養(yǎng)體系可將大鼠肝干細胞培養(yǎng)傳代達8代，分化培養(yǎng)體系可以誘導肝干細胞分化成具有肝細胞樣表型及功能的肝細胞樣細胞，經門靜脈及脾臟均可進行細胞移植，脾內環(huán)境也適合移植細胞的生長。 2.采用

9、人急性肝功能不全的病理血清可以篩選、純化人骨髓肝干細胞，獲得純化的肝干細胞后進行擴增培養(yǎng)目前可獲得肝干細胞傳代5代，具有與肝卵圓細胞相似的細胞表面標志，誘導分化后具有肝細胞樣的表型特征及功能。 第二部分，肝癌術后肝再生狀態(tài)與肝癌復發(fā)關系的初步研究摘要原發(fā)性肝癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，由于多數(shù)合并肝硬化并且難于早期診斷，預后極差。肝癌的治療，目前最有效的方法是手術治療，然而術后腫瘤的復發(fā)和轉移仍嚴重影響患者的生存率。近年

10、來，對肝癌復發(fā)的危險因素進行了廣泛的研究，腫瘤的生物學特性是目前研究的重點。腫瘤生物學特性也是多方面的，包括腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、腫瘤包膜完整性、門靜脈癌栓、腫瘤的分化程度、p53基因突變、癌周組織的雄激素受體以及癌細胞DNA倍體情況等多個因素，至今尚缺乏判斷肝癌術后預后有效的指標。 我們注意到，腫瘤細胞的生長取決于腫瘤細胞本身的特性及腫瘤細胞所處的環(huán)境。肝切除后肝臟即進入增殖狀態(tài)，引起一系列肝再生因子水平的變化，這些因子一方面使

11、肝再生精確、有序地進行，另一方面也有可能影響腫瘤細胞所處的環(huán)境，導致腫瘤的復發(fā)。其中，肝細胞生長因子是肝細胞最強烈的增殖刺激因子和促有絲分裂原，與腫瘤細胞的生長、浸潤及轉移關系密切。 結論：1.肝切除后，患者血清HGF水平升高，術后10天左右出現(xiàn)高峰期，14天HGF水平開始降低。大肝癌患者的升高水平明顯高于小肝癌患者，而TAE患者術后略為增高，手術患者的HGF水平與TAE患者相比各時段均有顯著意義(p＜0.05) 2.R

12、T-PCR結果顯示，術后不同復發(fā)時段肝癌組織均存在c-metmRNA的轉錄，且半定量結果顯示均比癌旁組織高，復發(fā)時間越短，轉錄水平越高；WesternBlot結果從蛋白水平證明復發(fā)時間早的患者其c-met蛋白的表達水平高，與病理結果相比較，復發(fā)時間早的患者病理惡性程度高。 3.根據(jù)以上結果，肝癌細胞表達c-met蛋白的水平可能反映腫瘤的惡性程度，與術后復發(fā)有一定的關系，從而可評估手術的預后；針對術后肝再生期對肝癌患者進行抑制腫瘤