炎癥反應及PKA-CREB信號途徑介導帕瑞昔布腦保護機制的探討.pdf

1、腦缺血一定時間恢復血液供應后,其功能不但未能恢復,卻出現了更加嚴重的腦機能障礙,稱之為腦缺血/再灌注(Ischemic-reperfusion,I/R)損傷。臨床麻醉中頸動脈瘤手術、顱內動脈瘤切除術、心肺復蘇過程中均不可避免地發(fā)生腦缺血再灌注損傷,影響了患者術后預后,這引起了麻醉工作者的重視,如何防治腦缺血再灌注損傷已成為科研的重要內容之一。
　　環(huán)氧化酶(Cyclcoxygenase,COX),又稱前列腺素內過氧化物合成酶,是前

2、列腺素(Prostaglandin,PG)合成過程中一個重要限速酶,催化花生四烯酸經由PGG2轉化成PGH2。COX分為結構型(COX-1)和誘導型(COX-2)。COX-1被認為是“看家基因”,在大多數正常組織中的表達穩(wěn)定;而COX-2被認為是“快速反應基因”,靜息時不表達,僅在細胞受到刺激時迅速合成,細菌脂多糖、生長因子、促炎細胞因子、促腫瘤劑可促進COX-2表達增加?；诖巳藗兺茰yCOX-2是在炎癥和其他病理情況中的主要存在形式。

3、大量研究表明COX-2在缺血性腦損傷中至關重要。在離體實驗以及不同腦缺血、腦出血、腦外傷實驗模型中,抑制COX-2可以起到一定的神經保護保護作用。盡管2004年9月Merck公司自愿召回因長期慢性服用導致嚴重心血管事件的羅非考昔(商品名:萬絡),但是抑制缺血性神經元表達COX-2、COX-2下游損傷因子仍然是令人感興趣的研究方向。諸多動物實驗都證實短期給予COX-2抑制劑并不加重腦損傷,但是真正應用于臨床時,臨床醫(yī)師還是有所顧慮的。相對

4、于其它COX-2抑制劑,臨床上更易接受帕瑞昔布。帕瑞昔布(商品名:特耐)是第二代COX-2抑制劑,是唯一可以經靜脈注射或肌內注射的高選擇性COX-2抑制劑,現用于術后疼痛的短期治療,不良反應少。目前研究發(fā)現帕瑞昔布能減輕心肌缺血性損傷,抑制心肌細胞死亡,改善心臟功能。但帕瑞昔布介導的腦保護機制目前仍不清楚,值得我們深入研究。越來越多的研究證據表明神經炎癥在腦缺血損傷進展中發(fā)揮著舉足輕重的作用。由于磷脂酶的協調作用,缺血后的膜磷脂釋放大量

5、游離的花生四烯酸,經由COX的花生四烯酸代謝途徑在腦血管閉塞后的神經炎癥中發(fā)揮著積極作用,是各種形式腦損傷包括腦缺血中觸發(fā)和促進炎癥進展的重要成分。人們已經在心肌缺血再灌注模型中發(fā)現抑制高遷移率族蛋白1(High mobility group box 1 protein,HMGB1)表達可以有效發(fā)揮心肌保護作用,我們推測抑制炎癥介質HMGB1表達有可能介導帕瑞昔布的神經保護機制。蛋白激酶A(Protein kinase A,PKA)/c

6、AMP反應元件結合蛋白(cAMP-response element-binding protein,CREB)信號轉導途徑是重要的神經保護機制之一,在神經發(fā)育、神經再生、記憶功能、突觸可塑性及細胞修復中發(fā)揮著中樞性作用。自噬性程序性細胞死亡即II型程序性細胞死亡,不同于細胞凋亡,吸引了越來越多研究人員的關注。在缺血、炎癥等應激狀態(tài)下,自噬可以被激活且與細胞死亡密切相關。研究發(fā)現Beclin1在心肌缺血再灌注階段的自噬現象中發(fā)揮著重要的作

7、用。因此,本課題選用遠端大腦中動脈永久性阻斷后再阻斷雙側頸總動脈60min的缺血再灌注模型,于缺血前15min、缺血后12h經陰莖背靜脈注射帕瑞昔布,探討炎癥反應、PKA/CREB、自噬是否參與了其神經保護作用。
　　本課題首先通過評估再灌注后大鼠神經功能缺陷評分、腦梗死體積百分比,觀察不同劑量的帕瑞昔布是否對Sprague-Dawley大鼠腦缺血再灌注損傷具有保護作用;其次,第二部分通過評估再灌注后大鼠神經功能缺陷評分、腦梗死體

8、積百分比、缺血側大腦皮層神經元HE染色及Nissl染色形態(tài)學變化、缺血半影區(qū)炎癥介質TNF-α、HMGB1表達,提示帕瑞昔布可能通過抑制炎癥反應及炎癥介質表達而發(fā)揮有效的神經保護作用;隨后,第三部分給予特異性PKA抑制劑,觀察再灌注后大鼠神經功能缺陷評分、腦梗死體積百分比、缺血半影區(qū)p-CREB及腦源性神經營養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)的表達,探討帕瑞昔布介導的腦保護效應可能是激

9、活PKA/CREB途徑,增加p-CREB、BDNF的表達所致;最后,第四部分給予自噬抑制劑,觀察再灌注后大鼠神經功能缺陷評分、腦梗死體積百分比、缺血側大腦皮層神經元Nissl染色、缺血半影區(qū)Beclinl表達,推測帕瑞昔布可能通過抑制自噬:Beclin1表達而減少神經細胞死亡,減輕腦缺血再灌注損傷。本課題研究結果證實:
　　(1)靜脈注射不同劑量的帕瑞昔布均能明顯促進腦缺血后神經功能恢復,減小腦梗死體積,產生顯著的神經保護作用。但

10、未證實帕瑞昔布在本模型中的神經保護作用呈劑量依賴性;
　　(2)帕瑞昔布可能通過抑制炎癥反應及炎癥介質表達,減少缺血再灌注所致的神經元死亡,發(fā)揮顯著的神經保護作用;
　　(3)帕瑞昔布可能通過激活:PKA/CREB途徑,增加p-CREB的表達,進而上調BDNF表達,減輕腦缺血再灌注損傷,發(fā)揮神經保護作用;
　　(4)帕瑞昔布可能通過抑制自噬Beclin1表達,促進神經功能恢復,減少腦缺血再灌注造成的神經元死亡,發(fā)揮一定

11、的神經保護作用。
　　總之,腦缺血及再灌注所致的神經元損傷是一系列極為復雜的病理生理過程,而帕瑞昔布介導的神經保護機制也是一個多分子參與的多信號通路交織的復雜級聯反應。
　　第一章不同劑量帕瑞昔布對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用
　　目的:觀察靜脈注射帕瑞昔布4 mg/kg或20 mg/kg是否能發(fā)揮腦保護效應。
　　方法:健康雄性SD大鼠,體重300～350 g,隨機分為四組:假手術組(Sham)、缺血再灌注組

12、(I/R)、帕瑞昔布1組(Parecoxib1)、帕瑞昔布2組(Parecoxib2)。電凝左側大腦中動脈永久性阻斷(Permanent middle cerebral artery occlusion,pMCAO)后再阻斷雙側頸總動脈60min,缺血前15min、缺血后12h經陰莖背靜脈注射帕瑞昔布4 mg/kg或20 mg/kg。Sham組與I/R組注射等容積的生理鹽水。各組于麻醉5min、大腦中動脈永久性阻斷15min及再灌注15

13、min時分別記錄平均動脈壓、心率、體溫,并抽動脈血行血氣分析。再灌注Id、3d、7d時評估神經功能缺陷評分,再灌注3d時2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)法測定大鼠腦梗死體積百分比。
　　結果:各組pH值、動脈血二氧化碳分壓(PaCO2)、動脈血氧分壓(PaO2)、平均動脈壓(MAP)及體溫(T)差異無統汁學意義(P＞0.05);與I/R組相比,再灌注1d

14、、3d、7d時神經功能缺陷評分顯示Parecoxib1組和Parecoxib2組均能明顯改善神經功能(P＜0.05),但兩組之間比較無統計學差異(P＞0.05);與I/R組相比,再灌注3d時TTC染色顯示Parecoxib1組和Parecoxib2組均能明顯減少腦梗死體積百分比(P＜0.05),但兩組之間比較無統計學差異(P＞0.05)。
　　結論:靜脈注射不同劑量的帕瑞昔布均能明顯促進腦缺血后神經功能恢復,減小腦梗死體積,產生顯

15、著的神經保護作用。但未證實帕瑞昔布在本模型中的神經保護作用呈劑量依賴性。
　　第二章帕瑞昔布對腦缺血再灌注損傷炎癥反應的影晌
　　目的:觀察帕瑞昔布對大鼠腦缺血再灌注損傷后缺血半影區(qū)炎癥介質TNF-α、HMGB-1表達的影響。
　　方法:健康雄性SD大鼠,體重300～350g,隨機分為三組:假手術組(Sham)、缺血再灌注組(I/R)、帕瑞昔布組(Parecoxib)。缺血再灌注模型為pMCAO并阻斷雙側頸總動脈60m

16、in,缺血前15min、缺血后12h經陰莖背靜脈注射帕瑞昔布4mg/kg。Sham組與I/R組注射等容積的生理鹽水。再灌注1 d、3d、7d時評估神經功能缺陷評分、缺血側大腦皮層神經元HE染色及Nissl染色形態(tài)學變化、缺血半影區(qū)炎癥介質TNF-α、HMGB1表達;再灌注3d時TTC法測定大鼠腦梗死體積百分比。
　　結果:與I/R組相比,再灌注1d、3d、7d時,帕瑞昔布能明顯改善神經功能、減少TNF-α陽性細胞及HMGB1的表達

17、(P＜0.05);再灌注3d時,與I/R組相比,Parecoxib組能明顯減少腦梗死體積百分比(P＜0.05)。
　　結論:帕瑞昔布可能通過抑制炎癥反應及炎癥介質表達,減少缺血再灌注所致的神經元死亡,發(fā)揮顯著的神經保護作用。
　　第三章PKA/CREB信號途徑在帕瑞昔布腦保護效應中的作用
　　目的:探討PKA/CREB信號途徑在帕瑞昔布腦保護效應中的作用。
　　方法:健康雄性SD大鼠,體重300～350g,隨機分

18、為五組:假手術組(Sham)、缺血再灌注組(I/R)、帕瑞昔布組(Parecoxib)、帕瑞昔布+H-89組(Parecoxib+H-89)、H-89組(H-89)。缺血再灌注模型為pMCAO并阻斷雙側頸總動脈60min,缺血前30min腹腔注射PKA抑制劑H-89,缺血前15min、缺血后12h經陰莖背靜脈注射帕瑞昔布4mg/kg。再灌注1d、3d、7d時觀察神經功能缺陷評分、缺血半影區(qū)p-CREB及BDNF的表達;再灌注3d時TTC

19、法測定大鼠腦梗死體積百分比。
　　結果:與I/R組相比,再灌注1d、3d、7d時,帕瑞昔布能明顯改善神經功能、增加p-CREB及BDNF的表達(P＜0.05);再灌注3d時,與I/R組相比,Parecoxib組能明顯減少腦梗死體積百分比(P＜0.05);PKA抑制劑H-89能拮抗帕瑞昔布的腦保護效應(P＜0.05)。
　　結論:帕瑞昔布可能通過激活PKA/CREB途徑,增加p-CREB的表達,進而上調BDNF表達,減輕腦缺血

20、再灌注損傷,發(fā)揮神經保護作用。
　　第四章帕瑞昔布對腦缺血再灌注損傷自噬的影響
　　目的:觀察帕瑞昔布對大鼠腦缺血再灌注損傷后自噬的影響。
　　方法:健康雄性SD大鼠,體重300～350g,隨機分為四組:假手術組(Sham)、缺血再灌注組(I/R)、帕瑞昔布組(Parecoxib)、3-甲基腺嘌呤組(3-MA)。缺血再灌注模型為pMCAO并阻斷雙側頸總動脈60min,缺血前15min、缺血后12h經陰莖背靜脈注射帕瑞昔

21、布4mg/kg,3-MA組于缺血前15min側腦室給予自噬抑制劑3-MA600nmol。再灌注1d、3d、7d時觀察大鼠神經功能缺陷評分、缺血側大腦皮層神經元Nissl染色、缺血半影區(qū)Beclin1表達;再灌注3d時TTC法測定大鼠腦梗死體積百分比。
　　結果:與I/R組相比,再灌注1d、3d、7d時,帕瑞昔布、3-MA均能明顯改善神經功能、增加存活神經元、減少Beclin1表達(P＜0.05);再灌注3d時,與I/R組相比,Pa