Ag85A口服DNA疫苗的制備及其誘導T細胞亞群應答效應的研究.pdf

1、本文通過構建結核分枝桿菌Ag85A與真核表達載體：pCDNA3.1<'+>的重組DNA疫苗，并檢測其可在真核細胞內表達Ag85A蛋白，以陽離子脂質體為運載體，制成可供口服的DNA疫苗，經口途徑投與小鼠，檢測疫苗的體內體外免疫生物活性及其誘導T細胞亞群應答效應。 實驗材料： 一、主要儀器： 流式細胞儀，二氧化碳孵箱，倒置顯微鏡，酶標儀，離心機，低溫冰箱，超速離心機，超濾器，超凈工作臺等。 二、主要試劑：

2、 減毒鼠傷寒沙門菌X4064，RPMI1640培養(yǎng)基，pUCm-T載體，真核表達載體pCDNA3.1<'+>，DH 5α感受態(tài)細胞，鼠anti-TB Ag85A，柱式質粒小量抽提試劑盒，脂質體轉染試劑盒，膠回收試劑盒，T4 DNA連接酶，小牛血清，F(xiàn)ITC標記的羊抗鼠IgG，免疫組化ABC試劑盒，Western-blot相關試劑，結核分支桿菌H37Rv株，引物，PCR擴增試劑盒，IPTG、X-gal培養(yǎng)基，SDS-PAGE電泳相關試

3、劑，Xho Ⅰ及BamH Ⅰ，細胞因子ELISA檢測試劑盒等。 三、實驗動物： C57BL/6小鼠30只，6-8周齡，SPF級，購自中科院上海實驗動物中心。 實驗方法： 一、真核表達編碼Ag85A基因重組體的構建。 1、引物設計根據(jù)GenBank中Ag85A基因序列，PCR所用引物：上游引物5’ -CAGGATCCGCGCGCGCAGTCTGACCTAGTTGAGGATGC-3’，含BamHI酶切

4、位點：下游引物5’-GTCTCGAGAGGGCCGCCGCCGTTAATCGCT-3’含Xho Ⅰ酶切位點，并在ORF終止密碼子之后。Ag85A含信號肽序列。確?？寺』蜷_放讀碼框正確。 2、結核分支桿菌H37Rv株接種改良羅氏培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)8周，小量抽提DNA為模板，按照試劑盒操作說明書進行。 3、PCR技術擴增Ag85A基因94℃預變性15min，熱啟動后轉入94℃變性imin，60℃退火1.5min，72℃延伸

5、2min，進行30個循環(huán)，72℃延伸10min后終止反應。反應結束后取5ul產物于1％瓊脂糖凝膠電泳，鑒定正確后采用膠回收試劑盒純化PCR產物。 4、純化PCR產物TA克隆入載體pUCm-T載體按pUCm-T載體PCR擴增試劑盒建立反應體系：lOxbuffer 1ul，pUCm-T載體1ul，PCR產物3ul，T4 DNA連接酶1ul，加ddH<,2>O至10ul，25℃連接30min。連接產物轉化到受體菌DH 5α感受態(tài)細胞，

6、取100ul轉化后的菌液鋪于含氨芐青霉素(60ug/ml)、工PTG 4ul(200mg/ml)、X-gal 40ul(20mg/ml)的LB瓊脂平板，平放30min后，37℃倒置培養(yǎng)過夜(12-16小時)。 5、藍白斑篩選待藍色充分顯現(xiàn)，挑取白色菌落于含有氨芐青霉素(60ug/ml)的LB培養(yǎng)基，37℃200 RPM振搖培養(yǎng)過夜，并擴增Amp抗性克隆，質粒提取試劑盒小量抽提質粒。 二、穩(wěn)定高效表達Ag85A基因細胞系的

7、建立。 1、無內毒素重組質粒pCDNA3.1<'+>/Ag85A的提取按照Promega和V-gerle公司無內毒素質粒提取試劑盒說明書分別進行大量和中量重組質粒制備。 2、脂質體介導的K562細胞的轉染驗證重組質粒中目的基因的瞬時表達2ul脂質體與2ug重組質粒在不含抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基中共孵育15min后轉染K562細胞，37℃、5％CO<,2>孵育24h后，用含10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)4

8、8h。 3、重組質粒pCDNA3.1<'+>/Ag85A在K562細胞中表達的Ag85A蛋白鑒定在G418(400ug/ml)的細胞培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長的K562細胞生長密度達1×l0<'7>/ml時，PBS洗滌、離心收集細胞，運用細菌蛋白提取試劑盒裂解細胞。以12％分離膠，5％濃縮膠，進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色，脫色液脫色，拍照分析。 三、口服Ag85A DNA疫苗的體內表達和對T細胞亞群的影響。 1

9、、大量抽提無內毒素重組質粒pCDNA3.1<'+>/Ag85A，包裹陽離子脂質體，制備成可供口服的DNA疫苗。 2、C57 BL/6小鼠30只，雄性，隨機分為5組，每組6只，NS-生理鹽水組：JO-空質粒組：L+JO-脂質體+空質粒組組：JA-重組DNA組：L+JA-脂質體包裹的重組質粒組，共免疫3次，每次間隔2周，末次免疫后7天收集各組免疫小鼠的血清及脾細胞。JA和JO組小鼠分別經口灌飼100μg重組質粒pCDNA3.1<'+

10、>/Ag85A和100μg pCDNA3.1<'+>質粒載體。 實驗結果 1、真核表達編碼Ag85A基因重組體的構建重組質粒經PCR及雙酶切證實成功構建了攜帶Ag85A基因的重組真核表達質粒pCDNA3.1<'+>/Ag85A，后者成功轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5α。經測序分析所克隆1141bp Ag85A與GenBank中結核分枝桿菌Ag85A氨基酸同源性為100％。 2、脂質體最佳使用濃度驗證重組質粒pCDNA3

11、.1<'+>/Ag85A DNA轉染K562細胞時與脂質體Lipofectamine<'TM>2000的最適比例為2ug∶2ul，此時脂質體能夠成功介導轉染且對細胞毒性較小。 3.Ag85A蛋白的表達Western-blot及SDS-PAGE檢測轉染的K562細胞株存在分子量為32KD的Ag85A蛋白的表達，與成熟的Ag85A蛋白分子量一致，表明Ag85A基因在K562細胞中得到了表達，表達產物具有免疫反應性。以此作為構建口服脂

12、質體疫苗的依據(jù)。 4、G418篩選穩(wěn)定表達Ag85A蛋白的細胞株G418篩選48h后的轉染K562細胞株，800ug/／ml濃度殺死未轉染的正在分裂的細胞，400ug/ml為殺死未轉染的正在分裂的細胞的最低濃度，以此濃度為選擇壓力，防止質粒丟失。經過12周篩選，獲得穩(wěn)定表達Ag85A蛋白的細胞株，以FITC標記的二抗進行間接免疫熒光試驗，熒光顯微鏡下可觀察到大量黃綠色熒光，而對照組未見特異性熒光，大部分熒光染色細胞表達在細胞膜；

13、經流式細胞術分析表達Ag85A蛋白的細胞所占比例為41.73％。 5、口服免疫對小鼠脾細胞T細胞亞群的影響脂質體對T細胞無毒性，CD4<'+>T細胞及CD8<'+>T細胞的百分率均出現(xiàn)下調，其中空質粒組無顯著作用，無脂質體包裹的重組質粒組對CD4<'+>、 CD8<'+>T細胞有降低作用，但脂質體+重組質粒組對CD4<'+>、 CD8<'+>T細胞降低作用效果更明顯。 6、口服DNA疫苗后小鼠脾淋巴細胞的Th1型細胞因子

14、IFN γ和Th2型細胞因子IL-4分泌水平的檢測結果分泌IFN-y的Th1型細胞比率和血清中的IFN-γ水平下降，而分泌IL-4的Th2型細胞比率和血清中的IL-4水平升高。 7、血清中Ag85A特異性抗體產生水平的檢測結果用間接ELISA方法檢測血清中Ag85A特異性抗體的產生，血清中抗體滴度脂質體包裹的重組DNA組所產生的特異性抗體水平最高，抗體滴度為1∶160：重組DNA組為1∶80，而脂質體包裹的空質粒組和空質粒組無特

15、異性抗體產生。說明該口服疫苗可誘導一定的體液免疫。 8、脂質體包裹的重組質粒組血清中Th1型細胞因子IFN-γ的產生水平受到抑制。 9、血清中Th2型細胞因子IL-4的產生水平脂質體包裹重組質粒組相對較高，而其它各組無顯著差異。 研究結論： 1、經DNA序列測定證實插入片段的序列與與GenBank中結核分枝桿菌Ag85A核苷酸編碼的氨基酸同源性為100％，pCDNA3.1<'+>/Ag85A重組質粒構建成

16、功。 2、重組質粒pCDNA3.1<'+>/Ag85A DNA經脂質體轉染真核細胞表達的Ag85A蛋白具有免疫原性。 3、成功轉染并獲得穩(wěn)定表達Ag85A蛋白的K562細胞株，此細胞可用于Ag85A蛋白的大量制備及其它方面的研究。 4、口服自制Ag85A DNA疫苗可在體內表達并刺激抗Ag85A特異性抗體的產生。 5、口服自制Ag85A DNA疫苗下調了脾CD4<'+>T細胞和CD8<'+>T細胞亞群的數(shù)

17、量。 6、分泌IFN-r的Th1型細胞比率和血清中的IFN-r水平下降，而分泌IL-4的Th2型細胞比率和血清中的IL-4水平升高。提示脾CD4<'+>T細胞數(shù)量下降可能主要為Thl型細胞數(shù)量的下降，而Th2型細胞數(shù)量下降不明顯或沒有下降。 7、L+JA組IFN-r的分泌水平顯著低于L+JO組，提示載體質粒pCDNA3.1<'+>中所含的CpG基序可能具有刺激T細胞分泌IFN-r作用，而重組質粒pCDNA3.1<'+>/