pIRES-Ag85A-ESAT6抗結核二價DNA疫苗的構建及其免疫效應研究.pdf

1、目的
　　通過以pIRES質粒為載體構建可同時獨立表達Ag85A和ESAT6兩種抗原的抗結核二價DNA疫苗，并經體外實驗評價其免疫原性及免疫效應，為新型結核疫苗的研發(fā)提供新的思路和實驗基礎。
　　方法
　　1.根據(jù)GenBank報道的目的基因（Ag85A和ESAT6基因）全長序列和pIRES質粒酶切位點的特點，利用DNAClub及Premier Primer5軟件設計特異性引物。以結核桿菌標準株H37Rv的DNA為模版

2、，經PCR擴增Ag85A和ESAT6基因，分別用限制性內切酶NheⅠ、EcoRⅠ和SalⅠ、EagⅠ對擴增產物和pIRES空質粒雙酶切，經連接酶連接，構建pIRES-Ag85A-ESAT6重組質粒，并經菌液PCR、質粒雙酶切和質粒測序鑒定。
　　2.pIRES-Ag85A-ESAT6重組質粒鑒定構建成功后，轉入DH5α菌株，篩選重組質粒，并用質粒小提試劑盒分離純化質粒DNA。
　　3.將重組質粒采用脂質體法轉染至RAW264

3、.7細胞，于5％ CO2培養(yǎng)箱中，37℃，培養(yǎng)24～48h后，western blot法檢測質粒蛋白表達情況。
　　4.大量提取重組質粒，經三次肌肉注射質粒免疫BALB/c小鼠，每次間隔2w，末次免疫2w后，取小鼠血清，用ELISA法檢測血清中抗Ag85A抗體和抗ESAT6抗體情況。
　　5.同時無菌取小鼠脾細胞在Ag85A和ESAT6蛋白刺激下培養(yǎng)，用ELISA法檢測培養(yǎng)液中細胞因子（IFN-γ、IL-2、IL-4）分泌情

4、況。
　　結果
　　1.成功構建pIRES-Ag85A-ESAT6重組質粒，經PCR鑒定、質粒雙酶切，DNA凝膠電泳后，分別出現(xiàn)1017bp和288bp的條帶，與Ag85A和ESAT6的理論值相符，并經測序進一步鑒定構建成功。
　　2.分別將用三種濃度的pIRES-Ag85A-ESAT6重組質粒轉染至RAW264.7細胞后，經western blot鑒定證實了Ag85A和ESAT6兩種蛋白可在細胞內成功表達，且表達水平

5、與轉染劑量存在正相關。
　　3.ELISA法檢測免疫小鼠血清中抗Ag85A抗體和抗ESAT6抗體變化情況，發(fā)現(xiàn)轉染了pIRES-Ag85A-ESAT6質粒的二價疫苗組，相應的抗Ag85A抗體和抗ESAT6抗體明顯升高，(P＜0.05)，且IgG2a抗體升高明顯。
　　4.在細胞因子檢測中，pIRES-Ag85A-ESAT6質粒組的IFN-γ、 IL-2水平顯著升高(P＜0.05)，而IL-4的值均較低，組間無顯著差異性。