卡介苗分泌型Ag85A在番茄中表達的研究.pdf

1、研究背景 結核病一直是威脅人類健康的嚴重疾病。尤其在發(fā)展中國家，盡管不同程度地推行現(xiàn)代結核病控制策略，但是結核病疫情下降緩慢。目前我國約有活動性肺結核病人451萬，涂陽肺結核病人150萬，菌陽肺結核病人196萬。從估算的病例數(shù)來看，近10年來，活動性肺結核病人減少了約25％。全人口的結核感染率為44.5％，也就是說我國有近半的人口(約5.5億人)感染了結核桿菌，0-14歲兒童的結核感染率為9.0％。每年約有13萬人死于結核病，結

2、核病死亡仍然是其他各種傳染病和寄生蟲病死亡總和的2倍，結核病死亡平均年齡為55.2歲。 近20年來全球HIV/AIDS的流行加劇了結核病的疫情，結核病與HIV/AIDS的共同感染使人類面臨更加嚴峻的挑戰(zhàn)。結核病與HIV是潛伏感染期互相激活的危險因素，二者之間具有互相促進的協(xié)同作用，一方增強另一方的進展。一方面，受HIV感染后，免疫功能缺陷無力阻止結核分枝桿菌的生長和局部播散，使結核病成為HIV感染者中最常見的機會性感染和死亡的主

3、要原因。另一方面，受結核分枝桿菌感染后，其肉芽腫內(nèi)活化的巨噬細胞所產(chǎn)生的TNF-α(腫瘤壞死因子-α)可激活HIV的繁殖，加速其發(fā)展成為艾滋病。 卡介苗已經(jīng)使用將近100年，它對結核病的保護性作用是有限的。卡介苗能夠減少嬰幼兒的結核病發(fā)病率和死亡率，尤其減少粟粒性結核與結核性腦膜炎的發(fā)生，但對成人肺結核和肺外結核而言作用甚微，而成人肺結核是造成結核病死亡的主要原因，也是結核病的唯一傳染源。因此，發(fā)展具有流行病學作用的新疫苗是控制

4、結核病的首要任務之一。 抗原85A是分枝桿菌分泌到細胞外的主要蛋白質(zhì)，有分泌型和成熟型兩種形式，成熟型存在于分枝桿菌細胞培養(yǎng)濾液中，分泌型存在于細胞內(nèi)，包括成熟蛋白和一段信號肽。大量研究表明，Ag85A是分枝桿菌的主要保護性抗原之一。Ag85A的蛋白質(zhì)疫苗、DNA疫苗或表達Ag85A的重組病毒、BCG疫苗均能誘導機體免疫應答，并能抵抗結核分枝桿菌的侵襲。 植物組織內(nèi)表達抗原作為一種新興的疫苗生產(chǎn)方法，近年來受到研究者們的

5、重視。很多臨床前動物實驗和一些人體實驗顯示，植物組織細胞中表達的抗原蛋白質(zhì)能組裝成正確的空間結構，進行免疫接種后能誘導機體產(chǎn)生免疫反應并具有一定的保護作用。 因此，該研究選擇分泌型Ag85A的完整編碼基因fbpA為外源目的基因，進行黃櫻桃番茄遺傳轉化，對其在番茄組織中的表達進行初步研究，為進一步深入探索結核病植物疫苗奠定基礎。 材料與方法 用PCR方法從卡介苗D2株基因組DNA中分離目的基因fbpA，經(jīng)過純化回收

6、將其與克隆載體pUCm-T重組，得到重組體pUCm-T-fbpA后，轉入感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，對轉化子和重組體進行單菌落PCR、HindⅢ單酶切、BamHI+SacⅠ雙酶切以及DNA序列分析等鑒定。經(jīng)鑒定證實fbpA基因正確無誤后，從重組體pUCm-T-fbpA中用BamHⅠ+SacⅠ雙酶切下目的基因fbpA，與用相同雙酶切的植物表達載體pBI121在體外重組以獲得重組體pBI121-fbpA，將重組體轉入大腸桿菌DH5α細胞株中進

7、行鑒定，經(jīng)過單菌落PCR、BamHⅠ+SacⅠ雙酶切鑒定證實重組正確后，將重組質(zhì)粒pBI121-fbpA轉入土壤根癌農(nóng)桿菌EHA105細胞株中，經(jīng)過單菌落PCR、從轉化子EHA105中提取重組質(zhì)粒pBI121-fbpA擴增目的基因等步驟鑒定證實轉化正確后，將攜帶重組體pBI121-fbpA的農(nóng)桿菌株EHA105保存，以備在植物基因轉化過程中使用。 選取番茄栽培品種紅櫻桃與黃櫻桃子葉和下胚軸進行離體組織培養(yǎng)，以MS培養(yǎng)基作為基本培

8、養(yǎng)基，附加不同濃度的細胞分裂素ZT和生長素IAA，共組成四組培養(yǎng)基進行愈傷組織與芽誘導分化實驗。對選出的最佳外植體(黃櫻桃番茄子葉)分別進行卡那霉素、羧芐青霉素和頭孢霉素敏感性實驗。然后，用攜帶重組質(zhì)粒pBI121-fbpA的農(nóng)桿菌株EHA105懸浮培養(yǎng)液侵染預培養(yǎng)2天的子葉，菌液OD600約0.3左右，侵染10分鐘。接著在黑暗條件下將侵染過農(nóng)桿菌的子葉共培養(yǎng)3天(在農(nóng)桿菌增殖階段向YEB培養(yǎng)基中添加200uM乙酰丁香酮和5％葡萄糖，在

9、侵染子葉以及共培養(yǎng)階段向MS培養(yǎng)基中添加20uM乙酰丁香酮和5％葡萄糖)。然后，轉移子葉到附加10mg/L卡那霉素、500mg/L羧芐青霉素的培養(yǎng)基上進行選擇、抑菌培養(yǎng)。待不定芽分化出后切下轉移到附加10mg/L卡那霉素、500mg/L頭孢霉素的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)。待根分化生長后，經(jīng)過一段時間煉苗，將轉化植株逐步從培養(yǎng)室移至普通實驗室，再到室外，最后移栽大田。 取少量轉化植株幼葉直接裂解后用上清液作模板對目的基因進行擴增。然后再提

10、取轉化植株總DNA進行PCR分析、Southern印跡雜交分析，判斷外源目的基因fbpA是否整合到黃櫻桃番茄染色體DNA中。對經(jīng)過上述鑒定的陽性植株提取果實總蛋白質(zhì)，用Western印跡雜交分析fbpA基因在番茄組織中的表達。 結果 DNA序列分析顯示，fbpA基因有一個開放閱讀框，共有1014個堿基組成，上游是一段信號肽編碼區(qū)域，堿基數(shù)為129個，推測為43個氨基酸編碼，下游是Ag85A成熟蛋白質(zhì)編碼區(qū)域，堿基數(shù)為88

11、5個，推測為295個氨基酸編碼。fbpA基因在卡介苗D2株與1173P2株中的同源性為100％。對重組體pUCm-T-fbpA和DH5α轉化子、重組體pBI121-fbpA和DH5α/EHA105轉化子進行的鑒定均證實fpbA基因克隆與轉化正確。 黃櫻桃番茄與紅櫻桃番茄的子葉、下胚軸在四組培養(yǎng)基中經(jīng)過離體組織培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，只有黃櫻桃番茄子葉的再生頻率最高，出芽率達到100％，平均11天分化出不定芽，最佳培養(yǎng)基配方為附加1mg/LZ

12、T和0.8mg/LIAA的MS培養(yǎng)基。黃櫻桃番茄子葉在卡那霉素選擇培養(yǎng)基中生長明顯受到抑制，出愈率和出芽率顯著下降，而出愈時間和出芽時間明顯延長，當卡那霉素濃度達到10mg/L時完全抑制子葉分化。因此，以10mg/L卡那霉素作為外源目的基因轉化后的選擇壓。0-500mg/L羧芐青霉素對子葉分化沒有明顯影響，但是卻明顯抑制根生長，而相同濃度的頭孢霉素對根的分化與生長都沒有明顯影響。因此，在抑菌培養(yǎng)階段，芽分化期宜用500mg/L羧芐青霉素

13、，根分化生長期宜用500mg/L頭孢霉素。 子葉侵染、共培養(yǎng)轉化后轉移到附加10mg/L卡那霉素和500mg/L羧芐青霉素的MS培養(yǎng)基中進行選擇、抑菌培養(yǎng)時觀察到，轉化愈傷組織與轉化不定芽生長緩慢、數(shù)量顯著下降，每個外植體上最多只分化出1個不定芽。在未添加乙酰丁香酮和葡萄糖的對照組，轉化芽率約6.2％，而在添加了這兩種物質(zhì)的處理組，轉化芽率顯著提高，達到13.1％。將轉化芽移到10mg/L卡那霉素和500mg/L頭孢霉素的MS生

14、根培養(yǎng)基中誘導根分化生長，觀察到根生長緩慢，根數(shù)少。待根長出后即移到無抗生素的培養(yǎng)基中促進轉化植株生長，最后移栽大田。 對轉化植株進行分子檢測與鑒定的結果顯示，fbpA基因整合入黃櫻桃番茄染色體DNA中，在番茄果實中表達的蛋白質(zhì)Ag85A能被結核病人的血清識別。 結論 1.卡介苗D2株編碼分泌型抗原85A的基因fpbA與1173P2株的該基因同源性為100％。 2.黃櫻桃番茄子葉是優(yōu)良的外源基因轉化的受體