TGF-β1誘導(dǎo)人口腔鱗癌細(xì)胞中整合素β6表達(dá)的分子機制.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、研究目的:
  轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)是一種具有多種生物功能的細(xì)胞因子,與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)的整合素avβ6在口腔鱗癌細(xì)胞中都異常高表達(dá).而整合素avβ6的表達(dá)受關(guān)鍵性亞單位整合素β6(ITGB6)調(diào)控?;虻霓D(zhuǎn)錄調(diào)控與基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合狀態(tài)及組蛋白乙?;揎椕芮邢嚓P(guān)。本研究擬通過研究β6基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子的活化狀態(tài)及組蛋白乙?;揎棤顟B(tài),研究TGF-β1調(diào)控β6表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制,為進(jìn)一步探究整合素avβ6在

2、口腔鱗癌中過度表達(dá)的分子機制奠定基礎(chǔ)。
  材料和方法:
  用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人口腔鱗癌細(xì)胞,實時定量PCR以及Western blotting實驗檢測TGF-β1對β6表達(dá)的影響;利用mRNA穩(wěn)定性實驗檢測TGF-β1對β6的轉(zhuǎn)錄水平的影響是否與mRNA的穩(wěn)定性有關(guān);進(jìn)一步利用熒光素酶報告基因技術(shù)檢測β6基因啟動子中TGF-β1主要應(yīng)答區(qū);利用生物信息學(xué)方法并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)預(yù)測調(diào)控口腔鱗癌細(xì)胞TGF-β

3、1誘導(dǎo)的β6基因轉(zhuǎn)錄活性的可能順式作用元件及與之結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子;利用定點突變和染色質(zhì)免疫共沉淀方法確定調(diào)控口腔鱗癌細(xì)胞TGF-β1誘導(dǎo)的β6基因轉(zhuǎn)錄活性的主要順式作用元件及與之結(jié)合的反式作用因子;染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)檢測TGF-β1誘導(dǎo)的β6啟動子區(qū)組蛋白乙酰化水平以及乙?;D(zhuǎn)移酶在此區(qū)域的結(jié)合水平。
  結(jié)果:
  1. TGF-β1上調(diào)口腔鱗癌細(xì)胞整合素β6 mRNA和蛋白表達(dá).mRNA穩(wěn)定性實驗證明TGF-β1不能增強β

4、6 mRNA的穩(wěn)定性而上調(diào)β6轉(zhuǎn)錄水平。
  2.整合素β65’側(cè)翼區(qū)熒光素梅報告基因質(zhì)粒pGL2-B6(-3/+208)、pGL2-B6(-150/+208)、pGL2-B6(-421/+208)分別轉(zhuǎn)染SAS細(xì)胞,分析TGF-β1對其影響,整合素β6啟動子區(qū)-150~-421 nt是TGF-β1的主要應(yīng)答區(qū),結(jié)合生物信息學(xué)方法預(yù)測到改區(qū)域主要轉(zhuǎn)錄因子有AP-1、C/EBP、SRF,c-Myb對AP-1、C/EBP、SRF、c-

5、Myb結(jié)合位點進(jìn)行定點突變,結(jié)果顯示,AP-1、C/EBP、SRF的潛在結(jié)合位點可能涉及TGF-β1誘導(dǎo)的β6轉(zhuǎn)錄活性,進(jìn)一步用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(ChIP)發(fā)現(xiàn),TGF-β1促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子JunB、C/EBPα、SRF在口腔鱗癌細(xì)胞中與β6基因啟動子區(qū)-150~-421 nt結(jié)合增加,同時Western blotting結(jié)果顯示,TGF-β1促進(jìn)JunB、C/EBPα和SRF蛋白表達(dá)。
  3.染色質(zhì)免疫沉淀檢測到TGF-β1誘導(dǎo)

6、的β6啟動子區(qū)-150~-421 nt的乙?;揭约敖M蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶CBP結(jié)合量升高,其中組蛋白H3乙酰化水平在TGF-β1作用2h時達(dá)到最高,組蛋白H4乙?;胶虲BP結(jié)合量則在0.5h時達(dá)到最高。當(dāng)用siRNA使CBP基因表達(dá)靶向沉默后,TGF-β1誘導(dǎo)的β6 mRNA以及蛋白水平顯著降低。使用去乙?;敢种苿㎜BH589(10μM)、SAHA(1μM)作用于SAS細(xì)胞,能使TGF-β1誘導(dǎo)的β6 mRNA以及蛋白表達(dá)水平升高

7、。
  結(jié)論:
  1. TGF-β1誘導(dǎo)整合素β6 mRNA以及蛋白表達(dá)水平上調(diào),轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控是關(guān)鍵。
  2.整合素β6啟動子區(qū)對TGF-β1的主要應(yīng)答區(qū)位于-150~-421 nt,TGF-β1使此區(qū)域的反式作用因子AP-1亞單位JunB,C/EBPα,SRF結(jié)合增多從而使整合素β6啟動子轉(zhuǎn)錄活化
  3.整合素β6啟動子區(qū)-150~-421 nt組蛋白乙?;缴邊⑴cTGF-β1誘導(dǎo)的整合素β6轉(zhuǎn)錄活化

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