MiR-27a-b靶向沉默ABCA1對巨噬細胞膽固醇流出的影響.pdf

1、目的：研究顯示miR-27a/b參與調(diào)控動脈粥樣硬化（atherosclerosis, As）發(fā)生發(fā)展的眾多危險因素，其在As中的可能機制已由我們進行文獻歸納整理，并發(fā)表在《Atherosclerosis》，基于本研究團隊的工作，我們提出miR-27a/b通過調(diào)控影響膽固醇流出的關鍵蛋白ABCA1參與影響As的發(fā)生發(fā)展。因此，本論文擬探討miR-27a/b對ABCA1的表達及其介導的膽固醇流出的影響。
　　方法：運用生物信息學的方

2、法對miR-27a和miR-27b序列的保守性、區(qū)別、存在區(qū)域進行分析，并重點分析miR-27a/b與ABCA1的結(jié)合情況（包括保守性、結(jié)合位點、得分、結(jié)合自由能、結(jié)合堿基特征等）；雙熒光素酶報告基因檢測miR-27a/b與ABCA1的結(jié)合情況；轉(zhuǎn)染miR-27a/b mimics或inhibitor，采用qPCR和Western blot檢測人THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞、小鼠RAW264.7巨噬細胞源性泡沫細胞、人HepG2細胞中

3、ABCA1 mRNA和蛋白表達情況；采用H3標記的膽固醇孵育的方法，運用液體閃爍計數(shù)器（liquid scintillation counter）分析THP-1細胞內(nèi)的膽固醇流出情況，高效液相色譜儀（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）檢測THP-1細胞內(nèi)的總膽固醇、膽固醇酯和游離膽固醇含量，并計算膽固醇酯和游離膽固醇的比值；采用siRNA技術沉默ABCA1后，與miR-27a/b

4、mimics共轉(zhuǎn)染，進一步評價miR-27a/b對THP-1細胞膽固醇流出的影響。
　　結(jié)果：生物信息學顯示 miR-27a屬于基因間區(qū)域 miRNA，定位于19號染色體p13.13，miR-27b屬于內(nèi)含子型miRNA，定位于9號染色體q22.32，兩者都高度保守且只有一個堿基序列不同，miR-27a/b具有靶向結(jié)合 ABCA1的基礎，且高度保守、得分較高、結(jié)合自由能較低；miR-27a/b mimics能夠顯著降低野生型的AB

5、CA1熒光素酶活性，但對突變型的卻無顯著影響；miR-27a/b mimics能夠顯著降低THP-1和RAW264.7巨噬細胞源性泡沫細胞、HepG2細胞ABCA1 mRNA和蛋白表達，miR-27a/b inhibitor則出現(xiàn)相反的結(jié)果；miR-27a/b mimics能夠顯著降低 apoA-1介導的膽固醇流出，且 ABCA1在其中發(fā)揮關鍵作用，miR-27a/b inhibitor則增加細胞內(nèi)的膽固醇流出；miR-27a/b mi

6、mics能顯著降低細胞內(nèi)的膽固醇酯含量，增加細胞內(nèi)的游離膽固醇含量，降低膽固醇酯和游離膽固醇的比值， miR-27a/b inhibitor則出現(xiàn)相反的結(jié)果，但miR-27a/b mimics/inhibitor卻都不影響細胞內(nèi)總膽固醇含量，提示miR-27a/b不僅影響細胞內(nèi)的膽固醇流出，還可能影響細胞內(nèi)膽固醇的攝取、合成、酯化和水解。
　　結(jié)論：miR-27a/b能夠通過靶向沉默 ABCA1減少細胞內(nèi)的游離膽固醇流出，但并不影