慢病毒載體介導(dǎo)的外源基因在HEK-293T細胞中的高效穩(wěn)定表達.pdf

1、基因工程(gene engineering)誕生于20世紀70年代，是指在體外將不同來源的基因分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，然后將其導(dǎo)入到合適的宿主細胞內(nèi)，從而使得外源基因在其中“安家落戶”并能持續(xù)穩(wěn)定的繁殖，以及在新的遺傳背景下實現(xiàn)功能表達和產(chǎn)生人類所需要的蛋白質(zhì)。
　　利用基因工程表達功能蛋白和一些具有重要研究價值的蛋白是基因工程的重要內(nèi)容，目前利用基因工程表達外源蛋白的研究已經(jīng)被廣泛應(yīng)用在衛(wèi)生保健、

2、科學研究和工業(yè)等各個不同的領(lǐng)域。外源蛋白的主要表達系統(tǒng)包括大腸桿菌表達系統(tǒng)、酵母表達系統(tǒng)、昆蟲細胞表達系統(tǒng)和哺乳動物細胞表達系統(tǒng)。每種表達系統(tǒng)有其各自的優(yōu)點，同時在重組蛋白生產(chǎn)的種類、數(shù)量以及操作的簡易性和生產(chǎn)成本等方面也有各自的制約。
　　大腸桿菌表達系統(tǒng)是最古老的、應(yīng)用最廣泛的一種原核表達系統(tǒng)。它的優(yōu)點是人們對它的背景研究最透徹、操作方便、生產(chǎn)成本低和重組蛋白產(chǎn)量高。但它也有明顯的缺點，例如缺乏真核系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄及翻譯后的表達修飾加

3、工功能，所生產(chǎn)的蛋白活性差，常以不溶性的包涵體形式表達，且其細胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素。
　　酵母表達系統(tǒng)不僅具有原核表達系統(tǒng)生長迅速和表達量高的特點，同時還有蛋白質(zhì)加工、折疊、翻譯后修飾等的功能。其缺點是在表達外源基因時常常會造成產(chǎn)物蛋白的不均一、降解和信號肽加工不完全等問題。且它只具有真核生物表達系統(tǒng)的部分加工修飾功能，無法加工修飾結(jié)構(gòu)復(fù)雜的外源蛋白。
　　昆蟲細胞表達系統(tǒng)由于其表達量高且具有比較完善的蛋白翻譯后加T

4、修飾功能，正被廣泛應(yīng)用于復(fù)雜生物蛋白的生產(chǎn)。但其糖基化的寡糖鏈與哺乳動物細胞系統(tǒng)有所差別，不能正確的修飾加工復(fù)雜哺乳動物蛋白的N-糖基化，且操作繁瑣、培養(yǎng)成本較高。
　　相反的，哺乳動物細胞表達系統(tǒng)則很好地克服了上述各載體的缺點，具有非常完善的糖基化修飾功能和折疊機制，可以理想地對表達的蛋白進行翻譯后加工、修飾并分泌到細胞外，相對于原核、酶母及昆蟲細胞等表達系統(tǒng)，哺乳動物細胞表達系統(tǒng)表達的蛋白活性更接近于天然蛋白，更適合于各種生物

5、蛋白的表達。因此，哺乳動物細胞表達系統(tǒng)有望成為理想的真核生物蛋白表達系統(tǒng)，盡管其也存在一些缺點，如蛋白表達量低、基因表達調(diào)控復(fù)雜、花費時間長且成本更高等。
　　外源蛋白的有效表達需要選擇合適的表達系統(tǒng)，同時必須考慮蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度、技術(shù)條件、實驗要求等因素。哺乳動物細胞表達系統(tǒng)雖然表達量低，但因其能正確表達出活性接近天然蛋白的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的外源蛋白，因此成為目前蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)發(fā)展的主流方向。而哺乳動物細胞表達系統(tǒng)應(yīng)用于表達外源蛋白的一個

6、關(guān)鍵步驟就是獲得一個能穩(wěn)定高效表達外源基因的克隆。目前將外源基因?qū)爰毎饕袃煞N方法，一種就是利用化學方法（比如脂質(zhì)體、磷酸鈣、PEI等）或物理方法（例如顯微注射、電穿孔等）通過瞬時轉(zhuǎn)染直接將DNA導(dǎo)入細胞;另一種就是利用病毒載體感染介導(dǎo)外源基因進入細胞，如慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體等。瞬時轉(zhuǎn)染方法通常表達效率低、成本高且整合基因不穩(wěn)定，外源基因有可能隨細胞分裂而逐漸丟失，目的蛋白的表達時限短暫。而病毒載體如慢病毒載體介導(dǎo)

7、的感染通常表達效率高且外源基因能與細胞基因組發(fā)生重組，從而實現(xiàn)目的蛋白的持久、穩(wěn)定表達。
　　慢病毒載體(Lentiviral vector, LV)是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的一種亞型，是在HIV-1病毒基礎(chǔ)上改建而來的病毒載體系統(tǒng)，能高效地將目的基因?qū)雱游锘蛉说脑毎蚣毎抵?。慢病毒載體基因組是正鏈RNA，其基因組進入細胞后，能在反轉(zhuǎn)錄酶及整合酶的作用下將病毒RNA反轉(zhuǎn)錄為DNA并整合到細胞基因組中。整合后的DNA在細胞中轉(zhuǎn)錄成m

8、RNA，回到細胞漿中，翻譯目的蛋白。慢病毒載體能有效感染并整合到分裂及非分裂細胞中，包括腦細胞、肝細胞、造血干細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞、巨噬細胞等。慢病毒載體介導(dǎo)的基因表達持續(xù)且穩(wěn)定，原因是目的基因整合到宿主細胞基因組中，并隨細胞基因組的分裂而分裂。
　　目前，病毒載體已成為動物體內(nèi)及體外表達外源基因的有力工具，慢病毒載體在人類細胞系中已經(jīng)被成功應(yīng)用于生產(chǎn)百毫克級別的有活性的外源蛋白。而要利用慢病毒載體在HEK293T細胞中高效穩(wěn)定

9、表達外源活性蛋白并以此為工具探索重組蛋白生產(chǎn)技術(shù)，建立快速生產(chǎn)平臺，我們需要選擇一個合適的慢病毒載體，然后利用這個載體攜帶外源基因在HEK-293T細胞中表達，并檢測其表達水平及穩(wěn)定性。
　　本文分為兩部分：
　　第一部分：通過比較包含不同表達元件的慢病毒載體介導(dǎo)的綠色熒光蛋白GFP在HEK-293T細胞中的表達水平及穩(wěn)定性，篩選一個合適的慢病毒載體。
　　第二部分：通過將丙型肝炎病毒(HCV)E1基因克隆到慢病毒表達

10、載體中，并包裝成慢病毒感染HEK-293T細胞后篩選單克隆細胞系，并檢測E1蛋白表達水平及穩(wěn)定性來檢驗這個慢病毒載體表達結(jié)構(gòu)復(fù)雜蛋白的能力，探索重組蛋白生產(chǎn)技術(shù)，建立快速生產(chǎn)平臺。
　　首先我們將包含不同表達元件的5個慢病毒表達載體，分別是包含HS4絕緣子和EF1α啟動子的pFIN-EF1α-GFP-2A-mCherH-WPRE，包含UCOE元件和SFFV啟動子的p'HR.cppt.3'1.2kb-UCOE-SFFV-eGFP，包

11、含CMV啟動子和β-globin內(nèi)含子的pTYF-CMV(β-globin intron)-eGFP和分別只包含CMV啟動子或EF1α啟動子的pTYF-CMV-eGFP和pTYF-EF1α-eGFP，與慢病毒包裝輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞包裝病毒并檢測病毒滴度，按MOI=1000感染293T細胞后每隔3-5天按1傳10的比例連續(xù)傳代，并利用熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測綠色熒光蛋白在HEK-293T細胞中的表達情況。
　　結(jié)果

12、顯示慢病毒包裝成功，滴度分別為2.8×108、3.7×108、2.5×108、1.0×109、2.5×108病毒基因組/毫升(vg/ml)。病毒感染細胞3天后，在熒光顯微鏡下都能觀察到感染細胞發(fā)出熒光，且經(jīng)傳3到5代后細胞的蛋白表達水平達到高峰并持續(xù)穩(wěn)定表達5周以上。感染細胞經(jīng)傳代9周后，細胞狀態(tài)仍然良好，感染細胞的活細胞率都大于80％。感染5周后細胞熒光率分別為22.7±3.3％、5.8±0.4％、54.1±3.7％、57.6±7.8

13、％和38.7±1.1％;而平均熒光強度分別為6391.7±1030.4、1436.0±1.4、21845.7±1959.0、26596.7±3900和9467.7±134.8。9周后，細胞熒光率分別為27.6±6.9％、5.9±0.2％、76.5±2.0％、91.7±1.7％和38.2±3.9％;平均熒光強度分別為1985.7±67.4、386.5±5.0、12814.7±1703.6、21192±882.7和1664.7±113.4。

14、
　　上述結(jié)果顯示單獨含CMV啟動子或包含CMV啟動子和β-globin內(nèi)含子的慢病毒載體介導(dǎo)的GFP在293T細胞中的表達效率最高。含HS4絕緣子和EF1a啟動子的載體介導(dǎo)的蛋白表達效率并沒有比單獨含EF1a啟動子的載體介導(dǎo)的表達效率高;含UCOE元件和SFFV啟動子的載體介導(dǎo)的蛋白表達水平明顯比其他載體介導(dǎo)的表達水平要低，這提示我們包含CMV啟動子的載體可以做為一個理想的慢病毒載體在HEK293T細胞中高效穩(wěn)定表達外源活性蛋白

15、。
　　為了進一步驗證含CMV啟動子的慢病毒在表達外源結(jié)構(gòu)復(fù)雜蛋白的能力，我們將HCV E1基因克隆到慢病毒載體pTYF-CMV-eGFP中得到表達載體pTYF-CMV-E1。經(jīng)瞬時轉(zhuǎn)染初步鑒定E1的表達后，將表達載體與慢病毒包裝輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞包裝成慢病毒載體，取一定量的LV-E1感染HEK-293T細胞，后用有限稀釋法篩選高效表達E1蛋白的單克隆細胞并進行消化傳代，通過Western Blot方法檢測單克隆細

16、胞系中E1蛋白的表達情況。
　　通過上述方法，我們成功構(gòu)建了含E1基因的慢病毒表達載體pTYF-CMV-E1，并通過瞬時轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞初步鑒定E1蛋白的表達，目的蛋白能正常表達并分泌到細胞培養(yǎng)上清中。我們成功包裝慢病毒載體LV-E1，并將一定量的病毒感染HEK-293T細胞后，通過感染細胞上清Western Blot鑒定表明重組慢病毒載體成功感染了HEK-293T細胞。后用有限稀釋法篩選得到能高效表達E1蛋白的單克隆細胞