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文檔簡介
1、Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是新近發(fā)現(xiàn)的模式識別受體,該家族通過識別病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMP)激活免疫細胞,在天然免疫防御病原體中起著重要作用。髓樣分化因子88(myeloiddifferentiation factor88,MyD88)作為一種細胞內(nèi)信號接頭蛋白,在TLR家族和白介素1受體(interleukin1
2、receptor,IL-1R)家族信號通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用。MyD88蛋白具有3個功能結(jié)構(gòu)域:N端的死亡結(jié)構(gòu)域(death domain,DD)、中間區(qū)域(intermediate domain,ID)及C端的Toll樣受體和白介素1受體相關(guān)結(jié)構(gòu)域(TLR/IL-1R related domain,TIR),其中MyD88蛋白的TIR結(jié)構(gòu)域能與TLRs和IL-1Rs的TIR結(jié)構(gòu)域相結(jié)合,從而介導(dǎo)信號向下游傳導(dǎo)。MyD88是重要的信號轉(zhuǎn)接蛋
3、白,其介導(dǎo)的信號通路與腸炎、動脈粥樣硬化、心肌肥大、癌癥等在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生和發(fā)展過程有著密切的聯(lián)系。MyD88的結(jié)構(gòu)和功能研究將為這些疾病的治療提供新的方向和思路。
本研究以水牛外周血白細胞為材料,提取總RNA,通過RT-PCR的方法擴增MyD88基因全長編碼序列,將其連接至pEGFP-C1質(zhì)粒,構(gòu)建pEGFP-C1-MyD88真核重組表達載體,重組載體經(jīng)菌落PCR、酶切和測序鑒定后,在脂質(zhì)體的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染進HEK293
4、細胞中,使其發(fā)生瞬時表達,并通過G418抗性篩選,構(gòu)建穩(wěn)定表達EGFP-MyD88融合蛋白的HEK293細胞系。結(jié)果表明:轉(zhuǎn)染48h后,綠色熒光蛋白在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細胞中呈顆粒狀散在分布,而在轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的細胞中均勻分布;Western Blot結(jié)果顯示在62 kDa處出現(xiàn)一條特異性抗體結(jié)合條帶;經(jīng)過G418的持續(xù)篩選,獲得了穩(wěn)定表達目的蛋白的陽性克隆,F(xiàn)CM分析結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染pEGFP-C1空質(zhì)粒的細胞系陽性率達93.35%,轉(zhuǎn)染重組質(zhì)
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