DOX可誘導的PENK基因在293T細胞中的表達.pdf

1、目的：
　　以前期實驗的載體PMT155(pLVX-TRE3G-MCS-PGK-3Gtransactivator-EGFP)構建含有DOX誘導基因PENK表達的慢病毒載體PSB2034（pLVX-TRE3G-PENK-PGK-3Gtransactivator-EGFP，含開關調控和靶基因)，使其感染293T細胞，獲得能在DOX存在的情況下穩(wěn)定表達腦啡肽的293T細胞，后續(xù)的研究可以以此作依據，臨床疼痛管理也可以此擴寬思路，尋求新療

2、法。
　　方法：
　　1.含有PENK基因的可調控載體的構建
　　在GENE BANK上查找目的基因，確定編碼區(qū)和非編碼區(qū)，由吉凱基因設計引物用于釣取PENK基因和鑒定轉化子。PCR反應體系進行擴增目的基因，之后使用瓊膠試劑盒進行目的基因片段切割、回收。把回收的目的基因同源重組入表達載體構建出載體PSB2034，進行轉化，取轉化子菌落進行PCR鑒定和基因測序。
　　2.293T細胞的包裝
　　復融并培養(yǎng)29

3、3T細胞使其細胞融合約80~90％。實驗組和對照組加入質粒（實驗組pSB2034對照組pMT155） dR8.9包裝質粒和VSVG包裝質粒進行慢病毒的包裝，而后包裝293T，并用DOX誘導,QPCR檢測出PENK過表達，WB檢出條帶反應。
　　結果：
　　對產物PSB2034進行測序與目的基因比證明無誤；感染過程中，用熒光顯微鏡觀察細胞，發(fā)現多于95%的細胞都帶有熒光，滴度檢測證明轉染成功，DOX誘導后可檢測出PENK基因過