壓力對(duì)小鼠成骨細(xì)胞增殖活性影響的基因表達(dá)譜差異分析.pdf

1、目的：在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中，機(jī)械力刺激無(wú)時(shí)無(wú)刻不在對(duì)機(jī)體產(chǎn)生著巨大的作用，尤其體現(xiàn)在骨骼發(fā)育、骨折愈合、骨改建等方面。在骨形成過(guò)程中，成骨細(xì)胞起著至關(guān)重要的作用，且對(duì)外界力學(xué)刺激敏感。以往學(xué)者認(rèn)為，壓力能促進(jìn)骨的吸收，不利于骨的形成。然而近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，適合的壓力可能會(huì)促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖分化，進(jìn)而對(duì)骨的形成起一定促進(jìn)作用，但目前的研究對(duì)成骨細(xì)胞受到力學(xué)刺激后細(xì)胞內(nèi)生物力學(xué)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)小鼠胚胎成

2、骨細(xì)胞MC3T3-E1形成3D細(xì)胞薄膜，利用FX-5000C壓力加載系統(tǒng)對(duì)其施加10％壓縮率，MTT法檢測(cè)壓力對(duì)小鼠成骨細(xì)胞增殖活性的作用，并利用Affymetrix基因表達(dá)譜芯片技術(shù)，分析壓力對(duì)小鼠成骨細(xì)胞差異基因表達(dá)的影響，探討壓力對(duì)成骨細(xì)胞的作用機(jī)制，為臨床研究骨改建的機(jī)理以及相關(guān)疾病的治療和恢復(fù)提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)參考。
　　方法：
　　1.小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1體外培養(yǎng):復(fù)蘇凍存的原代小鼠胚胎成骨細(xì)胞MC3T3

3、-E1，鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)瓶底，且生長(zhǎng)狀況良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。選取狀態(tài)良好、呈對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的 MC3T3-E1細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液，以1×105細(xì)胞/孔接種到12培養(yǎng)孔板上，培養(yǎng)28天，形成一層厚度約1~2 mm的3D細(xì)胞薄膜備用。
　　2.小鼠成骨細(xì)胞體外加載模型的建立:收集3D細(xì)胞薄膜，滴入到6個(gè)6孔壓力培養(yǎng)板中，將6個(gè)6孔壓力培養(yǎng)板隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組1小時(shí)（A1組）、4小時(shí)（B1組）、8小時(shí)（C1組），對(duì)照組1小時(shí)

4、（A2組）、4小時(shí)（B2組）、8小時(shí)（C2組）。利用FX-5000C細(xì)胞壓力加載系統(tǒng)對(duì)實(shí)驗(yàn)組施加頻率為1 Hz（正弦波形），10%的壓縮率，分別加壓1、4、8小時(shí)，對(duì)照組不加力，同樣條件下培養(yǎng)1、4、8小時(shí)。
　　3.小鼠成骨細(xì)胞增殖活性的檢測(cè):加力結(jié)束后，使用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖情況，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm處檢測(cè)各組細(xì)胞的吸光度值（OD值），記錄數(shù)據(jù)，并使用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　4.小鼠

5、成骨細(xì)胞總RNA的提取:選取增殖活性最強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)組和相應(yīng)對(duì)照組的細(xì)胞，使用TRIZOL法提取細(xì)胞的總RNA，測(cè)定RNA的純度、濃度及完整性。
　　5.小鼠成骨細(xì)胞基因芯片的制備及檢測(cè):將提取的總RNA標(biāo)本制備全基因組表達(dá)譜芯片，繼而進(jìn)行芯片的洗染和掃描，對(duì)得出數(shù)據(jù)進(jìn)行檢測(cè)并用Transcriptome Analysis Console3.0分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，篩選差異基因。
　　結(jié)果：
　　1.細(xì)胞增殖活性MTT實(shí)驗(yàn)

6、結(jié)果:對(duì)成骨細(xì)胞加壓1、4、8小時(shí)后，各實(shí)驗(yàn)組與相應(yīng)對(duì)照組吸光度均值（以(-x)±SD表示)， A1組：0.323±0.047， A2組：0.307±0.034；B1組：0.850±0.060，B2組：0.313±0.027；C1組：0.530±0.081，C2組：0.307±0.025；A1組與A2組吸光度值比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；B1組與B2組吸光度值比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；C1組與C2組吸光度值比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；三個(gè)對(duì)照組細(xì)胞吸光度值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)

7、差異；三個(gè)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞吸光度值比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。MTT結(jié)果表明：加力1小時(shí)時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組成骨細(xì)胞的增殖活性沒(méi)有顯著差異；加力4小時(shí)時(shí)，成骨細(xì)胞的增殖活性達(dá)到高峰，隨著加力時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的增殖活性逐漸降低。
　　2.總RNA的濃度、純度及完整性檢測(cè):利用Nanodrop2000/2000 C分光光度計(jì)測(cè)定結(jié)果顯示：B1組（加力4小時(shí)組）與B2組（4小時(shí)對(duì)照組）總RNA的OD260/OD280比值均位于1.8~2.0之間，純度及濃

8、度符合實(shí)驗(yàn)要求。凝膠電泳結(jié)果顯示：B1組（加力4小時(shí)組）與B2組（4小時(shí)對(duì)照組）RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后利用全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(GBOXF3)分析，可見(jiàn)三個(gè)條帶出現(xiàn)，28 S條帶亮度約為18 S條帶亮度的兩倍，5 S條帶較淡，說(shuō)明各組提取的總RNA完整性良好，符合實(shí)驗(yàn)要求。
　　3.小鼠胚胎成骨細(xì)胞MC3T3-E1全基因組mRNA表達(dá)譜差異分析在所分析的34472條小鼠全組基因中，篩選出基因信號(hào)上調(diào)和下調(diào)2倍及以上差異的全部基因，

9、B1組（加力4小時(shí)組）與B2組（4小時(shí)對(duì)照組）成骨細(xì)胞之間差異表達(dá)顯著的基因共出現(xiàn)3609條，其中上調(diào)的基因有1657條，下調(diào)的基因有1952條，這些基因的產(chǎn)物涉及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖、分化、凋亡等多個(gè)方面。
　　結(jié)論：
　　1.對(duì)成骨細(xì)胞施加適當(dāng)?shù)膲毫皶r(shí)間，能增強(qiáng)成骨細(xì)胞的增殖活性。
　　2.壓力下成骨細(xì)胞基因表達(dá)譜發(fā)生改變，Myc、Jun、Fos、Runx2、Wnt10b、Lrp5等成骨相關(guān)基因顯著上調(diào)。