氟對(duì)體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞中Ras基因表達(dá)的影響.pdf

1、目的：在驗(yàn)證及改良小鼠成骨細(xì)胞原代培養(yǎng)常用方法的基礎(chǔ)上，分別從蛋白質(zhì)及其mRNA表達(dá)水平檢測(cè)不同劑量氟對(duì)小鼠成骨細(xì)胞中Ras基因的影響；同時(shí)檢測(cè)不同劑量氟對(duì)人成骨細(xì)胞中RasmRNA表達(dá)量的影響。 方法：建立與改良小鼠成骨細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法，通過(guò)堿性磷酸酶和鈣結(jié)節(jié)染色方法進(jìn)行細(xì)胞來(lái)源鑒定；染氟劑量分別為：0mg/L、2.5mg/L、5mg/L、10mg/L和20mg/L；利用免疫組化、原位雜交、免疫印記和RT-PCR(rever

2、se transcri ption polymerase chain reaction)的方法檢測(cè)染氟后小鼠成骨細(xì)胞中Ras蛋白及mRNA表達(dá)水平；采用Real Time RT-PCR的方法測(cè)定染氟后人成骨細(xì)胞內(nèi)RasmRNA表達(dá)量的變化。 結(jié)果：改良后的細(xì)胞培養(yǎng)方法重復(fù)性好、成骨細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定、純化效果好，完全適和建立氟中毒的體外模型。小鼠成骨細(xì)胞染氟10天后，免疫組化和原位雜交結(jié)果顯示：對(duì)照組、2.5mg/L染氟組及5.0mg

3、/L染氟組成骨細(xì)胞中Ras基因均有較強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，但10.0mg/L、20.0mg/L染氟組的成骨細(xì)胞Ras基因則為弱陽(yáng)性表達(dá)；2.5mg/L組與對(duì)照組比較，2.5mg/L組的陽(yáng)性強(qiáng)度高于對(duì)照組，表達(dá)范圍也明顯大于對(duì)照組；而其余各染氟組與對(duì)照組比較，陽(yáng)性強(qiáng)度低于對(duì)照組，表達(dá)范圍也明顯小于對(duì)照組。陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示：各染氟組陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，2.5mg/L染氟組高于對(duì)照組，其它染氟組低于對(duì)照組；2.5

4、mg/L和5.0mg/L染氟組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)高于其它染氟組(P<0.05)，2.5mg/L組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)最高。小鼠成骨細(xì)胞的RasmRNA相對(duì)定量結(jié)果顯示：2.5mg/L染氟組高于對(duì)照組，其它染氟組均少于對(duì)照組；同時(shí)2.5mg/L染氟組大于其它染氟組；染氟組的RasmRNA相對(duì)定量有隨著劑量增加而逐漸降低的趨勢(shì)。小鼠成骨細(xì)胞的Ras蛋白相對(duì)定量結(jié)果顯示：2.5mg/L與5.0mg/L染氟組蛋白相對(duì)定量大于對(duì)照組，其它染氟組均小于對(duì)照組；同時(shí)，

5、5mg/L染氟組蛋白相對(duì)定量大于其它染氟組。人成骨細(xì)胞中RasmRNA相對(duì)定量顯示：2.5mg/L及以上劑量氟作用下人的成骨細(xì)胞中RasmRNA相對(duì)定量小于對(duì)照組。 結(jié)論：氟作用于小鼠成骨細(xì)胞后可以影響小鼠成骨細(xì)胞的Ras基因蛋白及mRNA的表達(dá)，表現(xiàn)為雙向作用即低劑量的氟對(duì)Ras基因蛋白及mRNA表達(dá)有促進(jìn)作用，高劑量的氟抑制Ras基因蛋白及mRNA表達(dá)。氟作用于人成骨細(xì)胞后可以影響人成骨細(xì)胞的RasmRNA的表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)劑量