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文檔簡介
1、第一部分:孕期酒精暴露對胎鼠心臟發(fā)育相關核心轉錄因子組蛋白乙?;揎椀挠绊?br> 目的:
探討孕期酒精暴露對HATs和HDACs活性及心臟核心轉錄因子GATA4、MEF2C、NKX2.5、TBX5的組蛋白乙酰化修飾狀態(tài)的影響。
方法:
受孕ED8.5的昆明小鼠隨機分為空白對照組和酒精組,酒精組于ED8.5給予56%酒精(5mg/kg·d)連續(xù)灌胃1周,空白對照組給予等量生理鹽水灌胃,收集ED14.5和E
2、D16.5胎鼠心臟及PND0.5和PND7新生鼠心臟進行如下檢測:
?。?)比色法檢測HATs和HDACs的活性;
?。?)Western blot檢測心臟組織中組蛋白H3AcK9及ac-H3的乙酰化水平;
(3)ChIP-Q-PCR檢測心臟核心轉錄因子GATA4、MEF2C、NKX2.5、TBX5啟動子區(qū)域組蛋白ac-H3、H3AcK9乙酰化水平;
(4)運用頂空氣相色譜法檢測孕鼠血液酒精濃度,并觀
3、察酒精相關副作用。
結果:
(1)以5mg/kg劑量酒精灌胃孕鼠40分鐘后,其血液酒精濃度達到147.5mg/100ml,且該劑量酒精所導致的流產、死胎及腸脹氣的發(fā)生率約為15%。隨著酒精劑量的增加其血液酒精濃度及相關副作用的發(fā)生率也逐漸增加。
?。?)比色法結果顯示在胎鼠心臟發(fā)育的ED14.5、ED16.5、PND0.5酒精可以提高胎鼠及新生鼠心肌組織中HATs活性,與空白對照組相比差異顯著(P<0.05)
4、,而對心肌組織中HDACs活性無明顯影響,與空白對照組相比無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
?。?)Western blot結果顯示孕期酒精暴露可以顯著提高胎鼠及新生鼠心肌組織中組蛋白ac-H3及H3AcK9乙?;剑≒<0.05)。
?。?)ChIP-Q-PCR結果顯示孕期酒精暴露可以顯著提高胎鼠和新生鼠心臟核心轉錄因子GATA4、MEF2C、NKX2.5、TBX5啟動子區(qū)域組蛋白ac-H3和H3AcK9乙?;剑≒
5、<0.05)。
結論:
?。?)孕期酒精暴露可以選擇性地提高胎鼠及新生鼠心肌組織中HATs活性,而對HDACs活性無顯著影響。
?。?)孕期酒精暴露可以顯著提高心肌組織中組蛋白ac-H3和H3AcK9乙?;?。
(3)孕期酒精暴露可導致心臟核心轉錄因子GATA4、MEF2C、NKX2.5、TBX5啟動子區(qū)域組蛋白ac-H3和H3AcK9高乙?;癄顟B(tài)。
第二部分:組蛋白乙?;笇π呐K發(fā)育相關
6、轉錄因子的組蛋白乙?;{控作用
目的:探討HATs對心臟核心轉錄因子GATA4、NKX2.5、MEF2C和TBX5啟動子區(qū)域組蛋白乙酰化調控作用。同時揭示酒精暴露所致的組蛋白高乙?;瘜π呐K核心轉錄因子GATA4、NKX2.5、MEF2C和TBX5轉錄活性的影響。
方法:
?。?)選取正常ED14.5胎鼠為研究對象,針對心臟核心轉錄因子GATA4、NKX2.5、MEF2C和TBX5啟動子區(qū)域前1000bp設計特
7、異性引物,分別以ChIP級抗p300、CBP、PCAF、SRC1、GCN5抗體做ChIP-PCR檢測HATs各個亞型對上述心臟核心轉錄因子的調控作用。
?。?)收集ED14.5、ED16.5胎鼠心臟及PND0.5、PND7新生鼠心臟;實驗設立空白對照組和酒精暴露組,針對心臟核心轉錄因子GATA4、NKX2.5、MEF2C和TBX5啟動子區(qū)域前1000bp設計特異性引物,分別以ChIP級抗p300、CBP、PCAF、SRC1、GC
8、N5抗體行ChIP-Q-PCR檢測酒精對上述心臟核心轉錄因子啟動子區(qū)域HATs各個亞型結合量的影響。
?。?)收集ED14.5、ED16.5胎鼠心臟及PND0.5、PND7新生鼠心臟;實驗設立空白對照組和酒精暴露組,針對心臟核心轉錄因子GATA4、NKX2.5、MEF2C和TBX5 CDS核心編碼區(qū)設計特異性引物,運用實時定量RT-PCR檢測上述心臟核心轉錄因子mRNA表達水平。
結果:
?。?)ChIP-PC
9、R結果顯示HATs亞型p300、CBP、PCAF、SRC1及GCN5均能結合到心臟核心轉錄因子GATA4、MEF2C、NKX2.5及TBX5啟動子區(qū)域。
(2)酒精暴露組HATs亞型p300、CBP、PCAF、SRC1在心臟核心轉錄因子GATA4、MEF2C、NKX2.5及TBX5啟動子區(qū)域的結合量顯著增高,與空白對照組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而HATs亞型GCN5在上述轉錄因子啟動子區(qū)域的結合量酒精組與空白對照組比
10、較無顯著差異(P>0.05)。
?。?)胎鼠心臟核心轉錄因子GATA4、MEF2C、NKX2.5及TBX5的mRNA表達水平在酒精暴露組高于空白對照組,且在ED14.5、ED16.5胎鼠心肌組織中GATA4 mRNA及MEF2C mRNA表達水平酒精組與空白對照組相比差異顯著(P<0.05);NKX2.5 mRNA表達量在ED14.5、ED16.5及PND0.5酒精組與空白對照組相比差異顯著(P<0.05);TBX5 mRNA表
11、達量在ED14.5酒精組顯著高于空白對照組(P<0.05)。
結論:
?。?)生理狀態(tài)下HATs亞型p300、CBP、PCAF、SRC1及GCN5均可以結合到心臟核心轉錄因子GATA4、MEF2C、NKX2.5及TBX5啟動子區(qū)域,參與上述轉錄因子組蛋白乙?;揎椪{控。
?。?)孕期酒精暴露可以顯著提高HATs亞型p300、CBP、PCAF、SRC1在心臟核心轉錄因子GATA4、MEF2C、NKX2.5及TBX
12、5啟動子區(qū)域的結合量。
?。?)孕期酒精暴露可以顯著提高胎鼠心臟核心轉錄因子GATA4、MEF2C、NKX2.5及TBX5的轉錄活性。
第三部分:漆樹酸抑制組蛋白乙?;抡{酒精誘導的心臟發(fā)育相關基因的過表達
目的:探討HATs抑制劑漆樹酸通過抑制組蛋白乙?;揎棤顟B(tài)從而下調酒精誘導的心臟核心轉錄因子GATA4、TBX5及心臟發(fā)育相關基因α-MHC、Cx43、cTnT、α-actin過表達的作用。
方
13、法:
選取昆明小鼠為研究對象,將ED8.5的孕鼠隨機分為空白對照組、空白對照+DMSO組、酒精組、酒精+DMSO組,酒精+DMSO+漆樹酸組、空白對照+DMSO+漆樹酸組。酒精組給予56%酒精(5mg/kg·d)連續(xù)灌胃1周,空白對照組給予等量生理鹽水灌胃,空白對照+ DMSO組給予等量生理鹽水灌胃的基礎上再給予等量DMSO腹腔注射,酒精+DMSO+漆樹酸組給予酒精(5mg/kg·d)灌胃,同時給予DMSO溶解的漆樹酸腹腔注射
14、(5mg/kg·d);在ED14.5收集胎鼠心臟進行以下檢測:
?。?)分別以抗HATs亞型p300、PCAF、SRC1抗體及抗H3AcK9抗體行染色質免疫共沉淀,針對心臟核心轉錄因子GATA4、TBX5啟動子區(qū)域設計特異性引物,運用Real-Time PCR擴增抗p300、PCAF、SRC1及H3AcK9抗體募集到的DNA片段,檢測p300、PCAF、SRC1在上述心臟核心轉錄因子啟動子區(qū)域的結合量及組蛋白H3AcK9乙酰化水
15、平。
?。?)實時定量RT-PCR檢測心臟核心轉錄因子GATA4、TBX5及心臟發(fā)育相關基因α-MHC、Cx43、cTnT、α-actin的 mRNA表達水平。
?。?)Western blot檢測組蛋白H3AcK9乙酰化水平及心臟發(fā)育相關基因α-MHC、Cx43、cTnT、α-actin的蛋白表達水平。
結果:
?。?)Western blot結果顯示酒精暴露組胎鼠心肌組織組蛋白H3AcK9乙酰化水平
16、顯著高于空白對照組(P<0.05),ChIP-Q-PCR結果表明心臟核心轉錄因子GATA4、TBX5啟動子區(qū)域組蛋白H3AcK9乙?;皆诰凭┞督M顯著高于空白對照組(P<0.05),而漆樹酸能夠顯著抑制酒精所致的組蛋白高乙酰化(P<0.05)。
?。?)ChIP-Q-PCR結果表明心臟核心轉錄因子GATA4、TBX5啟動子區(qū)域p300、PCAF、SRC1的結合量在酒精暴露組顯著高于空白對照組(P<0.05),漆樹酸能夠顯著降
17、低p300和PCAF在心臟核心轉錄因子GATA4、TBX5啟動子區(qū)域的結合量(P<0.05);但漆樹酸并不能降低SRC1在心臟核心轉錄因子GATA4、TBX5啟動子區(qū)域的結合量(P>0.05)。
(3)實時定量RT-PCR結果顯示酒精暴露可以顯著提高心臟核心轉錄因子GATA4、TBX5及心臟發(fā)育相關基因α-MHC、Cx43、cTnT mRNA表達水平(P<0.05),但酒精暴露并不能提高α-actin的mRNA表達水平(P>0
18、.05);漆樹酸能夠顯著下調酒精暴露所致的GATA4、TBX5、α-MHC、Cx43、cTnT的mRNA過表達(P<0.05)。
?。?)Western blot結果顯示孕期酒精暴露可以顯著提高胎鼠心臟發(fā)育相關基因α-MHC、Cx43、cTnT蛋白表達水平(P<0.05),但酒精暴露并不能提高α-actin的蛋白表達水平(P>0.05)。而漆樹酸能夠顯著下調酒精暴露所致的α-MHC、Cx43、cTnT的蛋白過表達(P<0.05)
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