基于SILAC定量蛋白質組學研究白花丹素殺傷舌鱗癌細胞的作用及其分子機制.pdf

1、研究背景：舌鱗狀細胞癌（簡稱舌鱗癌）（TSCC）是最常見的口腔頜面部惡性腫瘤，多發(fā)生于舌緣，因舌體具有豐富的淋巴、血液循環(huán)且舌的機械運動頻繁，舌鱗癌往往快速生長，呈現出浸潤性強、惡性程度高、頸淋巴結早期轉移的特點。盡管采用手術、放療及化療的綜合治療，舌鱗癌患者的五年生存率仍未有顯著改善，且化療極易產生耐藥，最終導致腫瘤復發(fā)。白花丹素是植物白花丹的根莖提取物，具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗癌等作用，而白花丹素對舌鱗癌的具體作用及機制尚不明確。

2、細胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標記（SILAC）技術具有高效標記、定量精確等優(yōu)點，是定量蛋白質組學的金標準，能夠系統(tǒng)揭示某一藥物作用于腫瘤細胞后細胞內全組蛋白的表達改變以及相關信號通路的調控變化。
　　研究目的：本研究旨在通過SILAC定量蛋白質組學技術揭示白花丹素殺傷舌鱗癌細胞的作用及其相關分子機制，并進一步探討白花丹素對舌鱗癌基礎化療藥物順鉑的增敏作用及機制。
　　材料和方法：
　　1.人舌鱗癌SCC25和CAL27細胞以及正

3、常人牙齦成纖維細胞HGF-1。
　　2. MTT法檢測白花丹素對SCC25、CAL27、HGF-1細胞的殺傷抑制作用及半數抑制濃度IC50。
　　3. MTT法檢測白花丹素對化療藥物順鉑的增敏作用。
　　4. SILAC定量蛋白質組學檢測白花丹素作用于舌鱗癌細胞后細胞內全組蛋白的表達改變以及相關信號通路的調控變化。
　　5.集落形成實驗檢測白花丹素和/或順鉑作用于舌鱗癌細胞后細胞集落的形成情況。
　　6.

4、PI流式細胞法檢測白花丹素和/或順鉑作用于舌鱗癌細胞后細胞周期的分布情況。
　　7. Annexin V: PE流式細胞法檢測白花丹素和/或順鉑作用于舌鱗癌細胞后細胞凋亡的誘導情況。
　　8. Cyto ID流式細胞法檢測白花丹素和/或順鉑作用于舌鱗癌細胞后細胞自噬的誘導情況。
　　9.共聚焦熒光顯微鏡檢測白花丹素作用于舌鱗癌細胞后細胞自噬的誘導情況。
　　10. CM-H2DCFDA法檢測白花丹素作用于舌鱗癌細

5、胞后細胞內活性氧水平。
　　11. Western blotting法檢測白花丹素作用于舌鱗癌細胞后上皮間質轉化及腫瘤干細胞樣特性蛋白的表達情況。
　　12. Western blotting法檢測白花丹素和/或順鉑作用于舌鱗癌細胞后信號通路蛋白的表達情況。
　　結果：
　　1.白花丹素作用后舌鱗癌細胞內全組蛋白及信號通路的改變
　?。?）白花丹素作用12、24、48和72 hr后，舌鱗癌SCC25細胞的I

6、C50分別為14.8、8.4、7.4、4.3μM；CAL27細胞的IC50分別為8.7、3.1、2.2、1.2μM；正常牙齦成纖維細胞HGF-1的IC50分別為35.7、29.9、17.4、8.1μM。
　?。?）SILAC定量蛋白質組學結果發(fā)現白花丹素能夠引起SCC25細胞中398種蛋白分子、101條信號通路的改變及 CAL27細胞中354種蛋白分子、100條信號通路的改變。
　　2.白花丹素誘導舌鱗癌細胞周期阻滯、凋亡與

7、自噬的作用及機制
　?。?）白花丹素以濃度/時間依賴的方式抑制SCC25、CAL27細胞集落形成。
　?。?）白花丹素以濃度/時間依賴的方式誘導SCC25和CAL27細胞G2/M期阻滯。細胞周期蛋白 cdc2、cyclin B1、Cdc25C的表達水平下降，而 p53、p27和p21的表達水平升高。
　　（3）白花丹素以濃度/時間依賴的方式誘導SCC25和CAL27細胞凋亡。細胞凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL的表達水

8、平下降，而Bax、PUMA、Cytochrome C、FADD、TRADD、DR5、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的表達水平升高。
　?。?）白花丹素以濃度/時間依賴的方式誘導SCC25和CAL27細胞自噬。細胞自噬蛋白Beclin1表達水平升高，且LC3-II/LC3-I的比值上升。
　　（5）較白花丹素單獨作用組，白花丹素分別聯合 SB202190、Doxorubicin作用時，舌

9、鱗癌細胞凋亡與自噬水平升高；白花丹素分別聯合Chloroquine、Z-VAD(OMe)-FMK作用時，舌鱗癌細胞凋亡與自噬水平下降；白花丹素分別聯合EGFR、Anisomysin、PA作用時，舌鱗癌細胞凋亡與自噬水平下降。
　?。?）白花丹素作用后，舌鱗癌SCC25、CAL27細胞中的p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR及p-p38 MAPK/p38 MAPK的比值均有不同程度的下降。
　　3

10、.白花丹素抑制舌鱗癌細胞上皮間質轉化及腫瘤干細胞樣特性的作用及機制
　?。?）白花丹素能夠顯著誘導舌鱗癌SCC25、CAL27細胞活性氧生成且該作用可被活性氧清除劑NAC、GSH阻斷。
　?。?）白花丹素作用后，舌鱗癌SCC25、CAL27細胞中p-p38 MAPK/p38 MAPK、n-Nrf2/c-Nrf2的比值及抗氧化反應元件NQO1、GST、HSP90蛋白的表達均下降。
　?。?）白花丹素能夠抑制舌鱗癌細胞上皮

11、間質轉化，在SCC25、CAL27細胞中，與空白對照相較，E-cadherin/N-cadherin的比值均升高。
　?。?）白花丹素作用后，舌鱗癌SCC25、CAL27細胞中的腫瘤干細胞樣特性蛋白Oct-4、Bmi-1、Nanog、Sox-2的表達水平下降。
　?。?）當白花丹素聯合 NAC、GSH作用時，較白花丹素單獨作用組，舌鱗癌SCC25、CAL27細胞的G2/M期、凋亡、自噬百分比均下降，而EMT及腫瘤干細胞樣特性

12、蛋白的表達水平升高。
　　4.白花丹素對舌鱗癌細胞順鉑化療增敏的作用及機制
　?。?）在SCC25細胞中，當順鉑單獨作用時，其IC50為2.937μM，當順鉑聯合5μM白花丹素作用時，IC50為0.634μM；在CAL27細胞中，當順鉑單獨作用時，其IC50為23.33μM，當順鉑聯合1μM白花丹素作用時，IC50為10.31μM。
　?。?）當順鉑聯合白花丹素作用時，較順鉑單獨作用組，SCC25、CAL27細胞中的集

13、落形成率均有不同程度的下降。
　?。?）當順鉑聯合白花丹素作用時，較順鉑單獨作用組，SCC25、CAL27細胞G2/M期細胞百分比均有不同程度的升高。
　　（4）當順鉑聯合白花丹素作用時，較順鉑單獨作用組，SCC25、CAL27細胞凋亡百分比均有不同程度的升高。
　?。?）當順鉑聯合白花丹素作用時，較順鉑單獨作用組，SCC25、CAL27細胞自噬百分比均有不同程度的升高。
　?。?）白當順鉑聯合白花丹素作用時，較

14、順鉑單獨作用組，SCC25、CAL27細胞中p-p38 MAPK/p38 MAPK、n-Nrf2/c-Nrf2、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR的比值均有不同水平的下降。
　　結論：
　　1.白花丹素能夠有效抑制舌鱗癌細胞的增殖活性，而不影響正常牙齦成纖維細胞的增殖；白花丹素能夠廣泛調控舌鱗癌細胞的細胞周期、凋亡、自噬、上皮間質轉化及氧化還原狀態(tài)。
　　2.白花丹素能夠以濃度/時間依賴

15、的方式抑制舌鱗癌細胞集落形成并且誘導細胞G2/M期阻滯；白花丹素通過抑制PI3K/Akt/mTOR及p38 MAPK信號通路誘導舌鱗癌細胞凋亡與自噬；白花丹素誘導的舌鱗癌細胞凋亡與自噬之間存在相互促進作用。
　　3.白花丹素通過抑制p38 MAPK/Nrf2信號通路誘導舌鱗癌細胞產生大量活性氧；白花丹素能夠顯著抑制舌鱗癌細胞上皮間質轉化及腫瘤干細胞樣特性；白花丹素誘導的活性氧參與調控舌鱗癌細胞的G2/M期阻滯、凋亡與自噬誘導及上皮