食管鱗癌組織與轉(zhuǎn)移淋巴結中的鱗癌細胞的蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、食管癌作為威脅中國人民健康的重大疾病，是常見的惡性腫瘤中的第四位，食管鱗形細胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是最主要的死亡原因之一，生存率很低的一個主要原因是腫瘤患者在初次診斷為食管癌時就已經(jīng)發(fā)生了腫瘤的轉(zhuǎn)移，其預后極差主要與患者發(fā)生的廣泛轉(zhuǎn)移有關。故此，腫瘤轉(zhuǎn)移已成為影響患者5年存活期的重要因素，其中食管床的局部淋巴結轉(zhuǎn)移(Regional lymph nodemetastasis

2、)在臨床上非常重要，理應受到密切關注。在大量有關食管鱗癌的研究中，尚未有食管鱗癌組織與轉(zhuǎn)移淋巴結中的鱗癌細胞的蛋白組學研究的報道，究其原因，可能與在轉(zhuǎn)移淋巴結中除了轉(zhuǎn)移的食管鱗癌細胞外，還存在大量的淋巴細胞、間質(zhì)細胞等，如何排除非癌細胞的干擾，以保證樣本的均質(zhì)性存在相當?shù)睦щy。 為了探討鱗癌細胞在食管鱗癌組織與轉(zhuǎn)移淋巴結中的蛋白質(zhì)表達差異，本研究首次應用激光捕獲顯微切割(Laser capturemicrodissection，

3、LCM)技術分離出正常食管上皮細胞、食管鱗癌組織和轉(zhuǎn)移淋巴結中的食管鱗癌細胞，使用差異蛋白質(zhì)組技術包括雙向凝膠電泳(Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2-DE)、基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時間質(zhì)譜(Matrix-assisted laserdesorption/ionization mass spectrometry-time of night，MALDI-TOF)技術

4、對這些細胞的蛋白進行分析，獲得了一些可能與食管鱗癌惡變、轉(zhuǎn)移過程有關的標志蛋白質(zhì)，推測其差異蛋白質(zhì)的功能，并從蛋白質(zhì)的整體水平上探討這些差異候選蛋白質(zhì)是否與食管鱗癌可能的發(fā)生或轉(zhuǎn)移機制相關，并為開展臨床早期診斷、尋找治療靶點等方面提供有價值的理論依據(jù)。 第一部分激光捕獲顯微切割技術在食管鱗癌蛋白質(zhì)組學研究中的應用 目的：探討激光捕獲顯微切割技術在獲得較單一食管鱗癌細胞中的價值，為食管鱗癌蛋白質(zhì)組學的研究奠定基礎。

5、 方法：通過激光捕獲顯微切割技術分別獲取食管鱗癌細胞和正常食管上皮細胞、食管鱗癌組織和轉(zhuǎn)移淋巴結中的鱗癌細胞。 結果：激光捕獲了較純的正常食管上皮細胞和食管鱗癌細胞、食管鱗癌組織和轉(zhuǎn)移淋巴結中的鱗癌細胞，分別獲得到了分辨率和重復性較好的雙向凝膠電泳圖譜。 結論：本研究結果提示激光捕獲顯微切割可以有效地解決組織異質(zhì)性的問題，能較好地獲取較為均一的目的細胞。 第二部分正常食管上皮細胞和食管鱗癌組織中的鱗癌細胞的差異蛋

6、白組學分析 目的：分析食管鱗癌和正常食管上皮細胞蛋白質(zhì)的表達差異，獲取兩者的蛋白表達差異。 方法：通過激光捕獲顯微切割技術分離食管鱗癌和正常食管上皮細胞的純細胞，通過雙向電泳和質(zhì)譜的方法檢測兩者表達的差異蛋白。 結果：分別發(fā)現(xiàn)了38-55個差異蛋白點，通過質(zhì)譜鑒定出20種有意義的蛋白，其中11種蛋白如galectin 7、14-3-3 protein ε等在食管鱗癌細胞表達明顯增高，9種蛋白如MTCBP-1等表達

7、下調(diào)。 結論：食管鱗癌和正常食管上皮細胞的2-DE蛋白質(zhì)圖譜具有明顯的差異表達，提示食管鱗癌的發(fā)生是多種蛋白質(zhì)功能共同作用的結果。 第三部分食管鱗癌組織和轉(zhuǎn)移淋巴結中的鱗癌細胞的差異蛋白質(zhì)組學分析 目的：分析食管鱗癌組織和轉(zhuǎn)移淋巴結中的鱗癌細胞的蛋白質(zhì)表達差異。 方法：通過激光捕獲顯微切割技術分離食管鱗癌組織和轉(zhuǎn)移淋巴結中的鱗癌細胞，通過雙向電泳和質(zhì)譜的方法檢測兩者表達的差異蛋白。 結果：分別發(fā)現(xiàn)

8、了20-29個差異蛋白點，通過質(zhì)譜鑒定出6種有意義的蛋白，轉(zhuǎn)移淋巴結中的鱗癌細胞中如等5種蛋白如peroxiredoxin 1，gelsolin family-capping proteins等表達明顯增高，1種蛋白MTCBP-1表達下調(diào)。 結論：食管鱗癌組織中的鱗癌細胞與轉(zhuǎn)移淋巴結中的鱗癌細胞的2-DE蛋白質(zhì)圖譜具有明顯的差異表達，提示這些蛋白質(zhì)可能與食管鱗癌的淋巴結轉(zhuǎn)移有關。 第四部分差異候選蛋白的驗證 目的

9、：為了保證鑒定結果的可靠性，以及便于將來這些蛋白作為臨床早期診斷的標志或作為治療的藥物時更易檢測，驗證差異蛋白確實在正常食管上皮組織、食管鱗癌組織和轉(zhuǎn)移淋巴結間存在顯著差異。 方法：使用westren blotting和免疫組化技術對差異候選蛋白進行差異分析、驗證。 結果：MnSOD、14-3.3 protein ε在食管鱗癌組織中的鱗癌細胞的表達高于正常食管上皮細胞的表達，Gelsolin family-capping