CBS基因干擾和OGD-R后SH-SY5Y細胞自噬和凋亡情況及相關信號通路研究.pdf

1、目的：
　　利用siRNA干擾技術干擾胱硫醚β-合成酶(cystathionineβ-synthase，CBS)基因并構建細胞氧糖剝奪再灌注(Oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R)模型，探討OGD/R和CBS基因干擾后SH-SY5Y細胞自噬和凋亡情況及相關信號通路變化。
　　方法：
　　構建OGD/R模型，體外模擬缺血再灌注過程，根據(jù)氧糖剝奪和再灌注時間不同共設9組，

2、分別為正常對照組，氧糖剝奪4h/再灌注12h組（4h/12h組），氧糖剝奪4h/再灌注24h組（4h/24h組），氧糖剝奪8h/再灌注12h組（8h/12h組），氧糖剝奪8h/再灌注24h組（8h/24h組），氧糖剝奪12h/再灌注12h組（12h/12h組），氧糖剝奪12h/再灌注24h組（12h/24h組），氧糖剝奪24h/再灌注12h組（24h/12h組），氧糖剝奪24h/再灌注24h組（24h/24h組）。利用透射電鏡(tran

3、smission electron microscopy，TEM)觀察各組細胞OGD/R后細胞內(nèi)自噬小體形成情況；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將靶向CBS基因的siRNA轉(zhuǎn)入SH-SY5Y細胞內(nèi)，同時構建OGD/R模型，氧糖剝奪4h/再灌注24h。將細胞分為3個組，分別為CBS干擾組，OGD/R組和CBS干擾+OGD/R組。CBS干擾組以陰性對照（與干擾組siRNA有相同的堿基組成但與靶mRNA無同源性的一段核苷酸序列）作為對照，OGD/R組以正常細胞

4、作為對照，CBS干擾+OGD/R組以陰性對照+OGD/R組作為對照組。為觀察轉(zhuǎn)染試劑對正常細胞的毒性作用，特增加正常對照組作為參照。以上各組各設3個復孔并進行3次獨立重復實驗；蛋白印跡法鑒定 CBS基因干擾效率，并檢測各組自噬相關蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1和信號通路中 Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR的蛋白表達水平，以及凋亡信號通路中NF-κBp65、COX-2蛋白表達水平；流式細胞術檢測各組細胞凋亡水平。

5、>　　結果：
　　1.透射電鏡觀察細胞內(nèi)自噬小體：除正常對照組和氧糖剝奪4h/再灌注12h組未觀察到自噬小體外，其余各組均在胞質(zhì)內(nèi)觀察到了較多自噬小體；2. CBS基因干擾效率：蛋白印記法檢測CBS蛋白表達，結果顯示，干擾組與陰性對照組比較 CBS蛋白表達量明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），陰性對照組與正常對照組比較 CBS蛋白表達水平并無明顯變化（P>0.05）。3.自噬相關蛋白及相關信號通路蛋白表達：3.1 CBS

6、干擾組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ，Beclin-1，p-Akt/Akt，p-mTOR/mTOR蛋白表達水平與陰性對照組比較均無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。3.2 OGD/R組與正常對照組比較，OGD/R組 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），Beclin-1蛋白表達無顯著差異（P>0.05），p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），NF-κBp65、COX-2蛋

7、白表達水平均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。3.3 CBS干擾+OGD/R組與陰性對照+OGD/R組比較，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ，Beclin-1，p-Akt/Akt，p-mTOR/mTOR均無顯著差異（P>0.05）。4.細胞凋亡檢測結果：4.1 CBS干擾組細胞凋亡率與陰性對照組比較無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。4.2 OGD/R組與正常對照組比較，OGD/R組細胞凋亡率明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.0