必特螺旋霉素生物合成調控的研究.pdf

1、必特螺旋霉素(Bitespiramycin，BT)已完成Ⅲ期臨床試驗，4"位的異戊?；梢栽黾悠浣M織濃度和體內抗菌活性，延長抗生素的半衰期，臨床研究結果表明，對上呼吸道細菌感染具有很好的療效，且口服劑量低，不良反應少。本文對BT生物合成基因進行深入研究，為提高BT產量提供了重要依據(jù)。
　　通過生物信息學分析，從BT產生菌的全基因組序列中得到BT的生物合成基因簇，在基因簇中有4個內源調控基因和一個外源調控基因acyB2,其中orf2

2、3和orf42與生二素鏈霉菌S.ambofaciens中的srm22和srm40基因同源，二者都是螺旋霉素(Spiramycin，SP)生物合成的正調控基因，acyB2與srm40也互為同源基因。對acyB2、srm40和srm22基因在大腸桿菌中進行異源表達研究，只成功表達表達并純化出Srm22可溶性蛋白，EMSA實驗證實Srm22蛋白能與srm40和外源調控基因acyB2的啟動區(qū)進行結合，卻不能與自身啟動區(qū)以及基因簇內其它結構基因的

3、啟動區(qū)結合。這說明Srm22不是直接調控結構基因，而是通過調控srm40和acyB2來影響B(tài)T的生物合成。
　　通過生物信息分析推測出全局性調控基因：亮氨酸響應蛋白基因（lrp）和光禿家族基因（bldD），兩者都參與調控BT的生物合成。在大腸桿菌中表達并純化出Lrp和BldD蛋白，EMSA實驗證實了Lrp能與acyB2、srm40和srm22的啟動區(qū)結合，說明Lrp可能對這三個調控基因具有調控作用;而BldD與acyB2、srm2

4、2基因的啟動區(qū)沒有特異性結合，說明BldD不直接影響這些調控基因的表達。
　　在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加L-Leu能明顯提高發(fā)酵產物中BT的比例，在生物合成途徑上L-Leu與BT的異戊?；鶄孺満铣擅芮邢嚓P。Lrp蛋白參與多個代謝途徑的調控，其中包括L-Leu的生物合成，我們刪除Lrp的L-Leu結合結構域，希望解除L-Leu生物合成的反饋抑制，增加異戊?；孜?。我們利用HPLC檢測SP及BT產量，發(fā)現(xiàn)在Δlrp-SP變株中，SP總比例由原

5、株的76.3％提高至81.5％，其中SPⅢ產量提高了88.6％，在Δlrp-BT變株中，ISP總比例由原株的17.7％提高至18.9％，其中ISPⅢ產量提高了212.1％，說明刪除Lrp的L-Leu結合結構域能提高SP與BT的產量與組分比例。氨基酸含量結果表明，Δlrp-SP變株內BCAAs(Val：32.0μg/g;Leu：37.8μg/g;Ile：13.5μg/g)比原株內BCAAs(Val：65.1μg/g;Leu：62.6μg/

6、g;Ile：25.1μg/g)含量低，說明刪除Lrp的L-Leu結合結構域能增加菌體內BCAAs的分解代謝。通過轉錄組分析，我們發(fā)現(xiàn)BT和SP生物合成途徑，丙氨酸生物合成途徑，?；o酶A代謝途徑等相關基因表達量提高。
　　BT化學結構中含有三個糖基，這些糖基對抑菌活性至關重要，orf21基因（NDP-氨基己糖N二甲基轉移酶基因），推測其參與BT左側糖基福洛氨糖的生物合成，為了證實其功能，我們將orf21基因進行阻斷，經(jīng)過抑菌活性測