重組有機磷水解酶發(fā)酵條件的優(yōu)化和酶制劑的研究.pdf

1、本文進行了重組甲基對硫磷水解酶(MPH)在大腸桿菌(Fscherichia coli)中表達條件優(yōu)化研究，根據重組表達菌株Ecoli B121(DE3)/pET29a-mpd的生長特性及產酶情況，在乳糖誘導下，經過單因素試驗和三因素三水平正交實驗，確定了最適搖瓶培養(yǎng)基成分，并使用優(yōu)化后的培養(yǎng)條件進行了7L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)，得到了甲基對硫磷水解酶活力18.69U/mL,酶活在搖瓶培養(yǎng)IPTG誘導的基礎上提高了10倍。 通過非變性Ni

2、-NTA金屬螯合親和層析對重組甲基對硫磷水解酶進行了純化，酶的比活提高了64.52倍，整個純化過程的酶活力回收率為53.63％。純化后的酶經SDS-PAGE驗證為電泳純。測定了重組甲基對硫磷水解酶降解甲基對硫磷的動力學參數(shù)，25℃時對甲基對硫磷的米氏常數(shù)Km為171.7μmol/L，kcat為30．2S<'-1>，Vmax為12.1μmol·L<'-1>min<'-1>。該酶水解甲基對硫磷的最適反應溫度在15℃，在低溫的條件下MPH的活

3、力比高溫的時候強；在不同溫度下長期保存結果表明，4℃～20℃穩(wěn)定性比較高，20℃以上酶活損失很大；該酶水解甲基對硫磷的最適反應pH為7.5，pH對酶的穩(wěn)定性有較大的影響，但在pH6．5～pH8．5左右時穩(wěn)定性較好；在不同pH的環(huán)境下長期保存，結果顯示pH6.5為該酶的最適保存pH，pH5.5～pH7.5范圍內較穩(wěn)定。而Fe<'2+>、Cu<'2+>、Co<'2+>、Mn<'2+>對酶有一定的激活作用，金屬螯合劑1，10-鄰菲洛林和EDT

4、A對MPH酶的活性基本無抑制作用，rween-20，Tween-80，Triton-100和SDS對酶的活性有強烈的抑制作用。 對重組甲基對硫磷水解酶粗酶液的保存條件進行了研究，發(fā)現(xiàn)聚乙二醇6000、硼酸、Na<,2>CO<,3>、NaCl、檸檬酸鈉、甲酸鈉、甘油、乙醇等物質，。對該酶在液體中的穩(wěn)定性有很好的保護作用，高濃度的Na<'+>對重組甲基對硫磷水解酶的降解活性有促進作用。根據對重組對硫磷水解酶粗酶液的穩(wěn)定性的影響，優(yōu)化