1.中國株cn54hiv1polp66p51在大腸桿菌中的表達與純化;2.鼠il12和il23作為基因佐劑與hiv1dna疫苗共免疫研究

1、華中農(nóng)業(yè)大學生命科學與技術(shù)學院2 0 0 4 年碩士學位論文P a r t I中 國 株C N 5 4 H I V - 1 P o l P 6 6 / P 5 1 在 大 腸 桿 菌中 的 表 達 與 純 化O v e r e x p r e s s i o n a n d P u r i f i c a t i o n i n E . c o l i o f P 6 6 a n d P 5 1 P r o

2、t e i n o fHI V - 1 S t r a i n C N5 4摘 要由 人類免疫缺陷病毒 ( H u m a n I m m u n o d e f i c i e n c y V i r u s , H I V ) 感染所引 起的艾 滋病 ( A c q u i r e d I m m u n o d e f i c i e n c y S y n d r o m e , A I D S ) 對人 類

3、健 康構(gòu)成了 嚴重的威脅， 研究一種快速有效的 適合國內(nèi)H I V 病毒感染的 檢測手段， 尤為重要。H I M p o t 基因主要編碼P 6 6 , P 5 1 . H 工 V - 1 逆轉(zhuǎn)錄酶 ( R T )分子由 2 個亞基組成( 5 . 1 x 1 0 ' k d 和 6 . 6 x l 0 ' k d ) , R T 是由 p o l 基因 編 碼以 一 種 多 蛋白 的 形式 表 達， 通 常在 感

4、染細胞中 微量 存在。 在病毒中， H I V - 1 R T 以 兩 相關(guān)多 膚p 6 6 和p 5 1 9 單 位二 聚體出 現(xiàn)， 分 子比 例為1 : 1 . P 5 1 亞單位是 p 6 6 亞單 位 C 端 裂解而 來。 p 6 6 亞單位由 兩 催化活性結(jié)構(gòu)域， 聚合酶， R N a s e H 區(qū) 域組成。 在異源二聚體H 工 V - 1 R T 中 p 5 1 僅僅包括聚合酶結(jié)構(gòu)域，不具有催化活性。由 于 H I

5、 V 的高 度變異 性， H I V p o l 基因 表達 產(chǎn)物誘導的 廣 泛交叉的 細胞免疫反應對于 研制預防 和治療性H 工 V 疫苗都具有十分重要的意義， p o l 基因成為越來越多的H I V 疫苗的重要組分，定量檢測P o l 抗原特異的細胞和體液免疫反應對于評價H I V 多價疫苗免疫原性十分重要。 此外， P o l 特異性的 抗體是確認H 工 V 感染的 重要指標。 因此， 制備高 純度的P o l 抗原對于 H

6、I V 多價疫苗的發(fā)展和H I V 感染的 都是十分必要的。本研究成功地利用大腸桿菌表達系統(tǒng)對H I V 中國 株C N 5 4 P o l P 6 6 和P 5 1 基因 進行了 非 融 合表 達，以C N 5 4 H I V 全 基因組克 隆為 模板 擴增p o l 基因p 6 6 和p 5 1 ， 再構(gòu)建到原核帶T 7 啟動子的高效表達載體p T H i o H i s A 中， 工 P T G 誘導表達， 利用離子交換與凝

7、膠過濾層析對重組抗原蛋白 進行純化， 并對其免疫學性質(zhì)進行了 研究。關(guān) 鍵詞: H I V l ; C N 5 4 ; P 6 6 ; P 5 1 ; 表 達; 純 化華中農(nóng)業(yè)大學生命科學與技術(shù)學院 2 0 0 4 年碩士學位論文前 言從 1 9 8 1 年開始， 美國疾病控制中 心( C D C ) 不斷收到有關(guān)卡波濟肉 瘤( k a p o s i 's a r c o m a )的 病例報告，由 于新發(fā)現(xiàn)的 病例與以 往

8、的 有所不同， 死亡率高， 而且發(fā)病率呈快速上升趨勢， 引 起了C D C 的高度重視， 1 9 8 2 年9 月， C D C 正式提出了 獲得性免疫缺陷綜合癥( a c q u i r e d i m m u n o d e f i c i e n c y s y n d r o m e , A I D S或艾滋病) 的 概念，隨后的調(diào)查研究證明 這是一種新的傳染病。1 9 8 3年，法國巴 斯德研究所的M o n t a g

9、 n i e r等 首先從一 例淋巴 瘤患 者的 淋巴 結(jié)中 分離出 一 種病毒， 被 稱為 淋巴 結(jié)病相關(guān)病毒 ( l y m p h a d e n o p a t h y a s s o c i a t e d v i r u s , L A V ) , 1 9 8 4年初， 美國國 立衛(wèi)生研究院國 立癌癥研究 所的 G a l l o等從艾滋病患 者的 外周血單核細胞 ( P B M C )中 分離到 稱為 人嗜T 淋巴

10、 細胞病 毒 I I I 型 ( h u m a n T - c e l l l y m p h o t r o p i c v i r u s t y p e1 1 1 , H T L V - I I I ) 的 病 毒。同 年， 美國 加州 大學的L e v y 等也從艾 滋病患 者的 外周 血淋巴 細胞中分離出一種病毒， 稱艾滋病相關(guān)病毒 ( A I D S r e l a t e d v i r u s , A

11、R V ) , 1 9 8 6年，國 際 病毒分類委員會 ( I n t e r n a t i o n a l C o m m i t t e e o n T a x o n o m y o f V i r u s e s ,I C T V ) 將 L A V / H T L V - I I / A R V 統(tǒng)一命名為人免疫缺陷 病毒 ( h u m a n i m m u n o d e f i c i e n c y

12、v i r u s , H I V ) ， 又 稱 艾 滋 病 毒。1 . H I V 簡介H I V 屬逆轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬， 其R N A 中 含有g(shù) a g , e n v和p o l 基因以 及6 種調(diào) 控 基因 ( t a t , v i f , v p r , v p x ( v p u ) , n e f , r e v ) , g a g 基因 編碼病 毒的 核心 蛋白( 如圖1 ) c p o l

13、 基因 編碼病毒復制所需要的酶類 ( 逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶和蛋白 酶) ;e n v 基因 所編碼病毒包膜蛋白， 是H I V 免疫學診斷的主要檢測抗原。 調(diào)控基因編碼輔助蛋白，調(diào)節(jié)病毒蛋白 合成和復制?，F(xiàn)有兩型H I V : H 工 V - 1 和 H 工 V - 2 ， 它們主要區(qū)別在于包膜糖蛋白 上。 H I V 是一種變異性很強的病毒， 不同的病毒株之間差異很大， 甚至同一毒株在同一感染者體內(nèi) 僅數(shù)月就可以改變， 使原中 和抗體失

14、去中 和效能， 這給H I V 疫苗的 研制造成很大困 難。目 前在全球流行的H 工 V - 1 毒株己出 現(xiàn)三個組，即M , 0 和N 組， 其中M 組又可分為A 到J 共 1 0 個亞型， 而且亞型間的 重組體已 有發(fā)現(xiàn)。 H 工 V - 2 現(xiàn)有A -F 共6個亞型。 目 前也有學者根據(jù)病毒的生物學特性對H I V - 1 進行分群， 如根據(jù)病毒與宿主細胞結(jié)合所利用的輔助受體的 不同 ( C C R 5 . C X C R 4