植物組織培養(yǎng)

1、第一章植物組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)知識(shí)組織培養(yǎng)的概念植物組織培養(yǎng)是指將植物的離體器官（如根、莖、葉、花、果實(shí)、種子等）、組織（如花藥、胚珠、形成層、皮層、胚乳等）、細(xì)胞（如體細(xì)胞、生殖細(xì)胞花粉等）以及去除細(xì)胞壁的原生質(zhì)體，甚至幼小的植株，放在無(wú)菌條件下，在人工控制的環(huán)境條件下，培養(yǎng)在培養(yǎng)基上對(duì)其進(jìn)行克隆，使其生長(zhǎng)、分化并成長(zhǎng)為完整植株的過(guò)程?？煞Q為離體培養(yǎng)或試管培養(yǎng)。組織培養(yǎng)的生理依據(jù)1細(xì)胞全能性學(xué)說(shuō)植物體的每一個(gè)細(xì)胞都攜帶有一套完整的基因組，并

2、具有發(fā)育成為完整植株的潛在能力。全能性只是一種可能性。要把這種可能性變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)性必須滿足兩個(gè)條件：一是要把這些細(xì)胞從植物體其余部分的抑制性影響下解脫出來(lái)，也就是說(shuō)必須使部分細(xì)胞處于離體的條件下。二是要給予它們適當(dāng)?shù)拇碳?，即給予它們一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并使它們受到一定的激素的作用。全能性體現(xiàn)的兩個(gè)過(guò)程一個(gè)已分化的細(xì)胞要表現(xiàn)它的全能性，必須經(jīng)歷兩個(gè)過(guò)程，即首先要經(jīng)歷脫分化過(guò)程，然后再經(jīng)歷再分化過(guò)程。再分化的過(guò)程有兩種方式：一是器官發(fā)生方式二是胚胎

3、發(fā)生方式2.激素（植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑）調(diào)控植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是培養(yǎng)基中的關(guān)鍵性物質(zhì)，用量極少，但起著十分重要明顯而調(diào)控作用。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑包括生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素及赤霉素等多種，它們?cè)谥参锝M織培養(yǎng)中具有不同的作用。（1）生長(zhǎng)素用于誘導(dǎo)愈傷組織的形成，體細(xì)胞胚的產(chǎn)生以及試管苗的生根，更重要的是配合一定比例的細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)腋芽和不定芽的產(chǎn)生。常用的生長(zhǎng)素:24—二氯苯氧乙酸（2，4D）、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）和吲哚丁酸（IBA）等。作用

4、強(qiáng)弱順序:2，4D＞NAA＞IBA＞IAA。(2)細(xì)胞分裂素促進(jìn)細(xì)胞分裂與分化，延遲組織衰老，增強(qiáng)蛋白質(zhì)合成，促進(jìn)側(cè)芽生長(zhǎng)及顯著改變其他激素作用的特點(diǎn)。常見(jiàn)的細(xì)胞分裂素有：2—異戊烯腺嘌呤（2iP）、玉米素（ZT）、6—芐基氨基腺嘌呤（6BA）、激動(dòng)素（KT）、苯基噻二唑基脲（TDZ）。作用強(qiáng)弱順序:TDZ＞2—ip＞ZT＞6—BA＞KT。(3)赤霉素在植物組織培養(yǎng)中應(yīng)用的僅有GA3一種，它是一種天然產(chǎn)物，能促進(jìn)已分化芽的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。其他

5、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑:如脫落酸（ABA）、乙烯利（CEDP）等在植物組織培養(yǎng)中也有一定的應(yīng)用。生長(zhǎng)素細(xì)胞分裂素的比值:大時(shí)有利于根的形成，這時(shí)生長(zhǎng)素起主導(dǎo)作用；比值小時(shí)，則促進(jìn)芽的形成，這時(shí)細(xì)胞分裂素起主導(dǎo)作用。此合成培養(yǎng)基后被稱為White培養(yǎng)基。Gautheret（1934）在山毛柳和黑楊等形成層組織的培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，雖然在含有葡萄糖和鹽酸半胱氨酸的Knop溶液中，這些組織也可以不斷增殖幾個(gè)月，但只有在培養(yǎng)基中加入了B族維生素和IAA以后，山

6、毛柳形成層組織的生長(zhǎng)才能顯著增加。這些實(shí)驗(yàn)揭示了B族維生素和生長(zhǎng)素的重要意義，又直接導(dǎo)致了1939年Gautheret連續(xù)培養(yǎng)胡蘿卜根形成獲得首次成功。同年，white由煙草種間雜種的瘤組織，Nobecourt由胡蘿卜也建立了類似的連續(xù)生長(zhǎng)的組織培養(yǎng)物。Gautheret，White和Nobecourt一起被譽(yù)為植物組織培養(yǎng)的奠基人。40年代和50年代初期，活躍在植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域里的研究者以Skoog為代表，研究的主要內(nèi)容是利用嘌呤類物

7、質(zhì)處理煙草髓愈傷組織以控制組織的生長(zhǎng)和芽的形成。Skoog（1944）和崔徵等（1951）發(fā)現(xiàn)，腺嘌呤或腺苷不但可以促進(jìn)愈傷組織的生長(zhǎng)，而且還能解除培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素（IAA）對(duì)芽形成的抑制作用，誘導(dǎo)芽的形成，從而確定了腺嘌呤與生長(zhǎng)素的比例控制芽和根形成的主要條件之一。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果導(dǎo)致了激動(dòng)素和以后利用激動(dòng)素和生長(zhǎng)素在組織培養(yǎng)中控制器官分化工作開(kāi)展。50年代開(kāi)始以后的10年中，引人注目的植物組織培養(yǎng)的研究進(jìn)展有以下6項(xiàng)：①1952年，Mel

8、和Martin首次證實(shí)，通過(guò)莖尖分生組織離體培養(yǎng)，可以由已受病毒侵染的大麗花中獲得無(wú)毒植株。②1953～1954年，Muir進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)獲得初步成功。并對(duì)分離的單細(xì)胞進(jìn)行了“看護(hù)培養(yǎng)”。實(shí)現(xiàn)Haberlt培養(yǎng)單細(xì)胞可能性的這一設(shè)想。③1955年，Miller等由鯡魚(yú)精子DNA中分離出細(xì)胞分裂素，并把它定名為激動(dòng)素（kiin）。具有和激動(dòng)素類似活性的合成的或天然的化合物已有多種，它們總稱為細(xì)胞分裂素（cytokinin）。應(yīng)用這類物質(zhì)，

9、我們就有可能誘導(dǎo)已經(jīng)成熟和高度分化的組織（如葉肉和干種子胚乳）細(xì)胞進(jìn)行分裂。④1957年，Skoog和Miller提出了有關(guān)植物激素控制器官形成的概念。指出在煙草髓組織培養(yǎng)中，根和莖的分化是生長(zhǎng)素對(duì)細(xì)胞分裂素比率的函數(shù)，通過(guò)改變培養(yǎng)基中這兩類生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的相對(duì)濃度可以控制器官的分化：這一比率高時(shí)促進(jìn)生根，低時(shí)促進(jìn)莖芽的分化。二者濃度相等時(shí)，組織則趨向于以一種無(wú)結(jié)構(gòu)的方式生長(zhǎng)。后來(lái)證明，激素可調(diào)控器官發(fā)生的概念對(duì)于多數(shù)物種都可適用，只是由

10、于在不同組織中這些激素的內(nèi)生水平不同，因而對(duì)于某一具體的形態(tài)發(fā)生過(guò)程來(lái)說(shuō)，它們所要求的外源激素的水平也會(huì)有所不同。⑤1958年，Wickson和Thimann指出，應(yīng)用外源細(xì)胞分裂素可促成在頂芽存在的情況下處于休眠狀態(tài)的腋芽的生長(zhǎng)。當(dāng)把莖尖接種在含有細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基上以后，將可使側(cè)芽解除休眠狀態(tài)，而且，能夠從頂端優(yōu)勢(shì)下解脫出來(lái)的不只是那些既存于原來(lái)莖尖上的腋芽，此外，還有由原來(lái)的莖尖在培養(yǎng)中長(zhǎng)成的側(cè)枝上的腋芽，結(jié)果就會(huì)形成一個(gè)郁郁蔥蔥

11、的結(jié)構(gòu)，里面包含了數(shù)目很多的小枝條，其中每個(gè)小枝條又可取出來(lái)重復(fù)上述過(guò)程，于是在相當(dāng)短的時(shí)間內(nèi)，就可以得到成千上萬(wàn)的小枝條。當(dāng)把這些小枝條轉(zhuǎn)夠到另外一種培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根以后，即可移植于土壤中。⑥1958～1959年，Reinert和Steward分別報(bào)道，在胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)中形成了體細(xì)胞胚。這是一種不同于通過(guò)芽和根的分化而形成植株的再生方式。現(xiàn)在知道有很多物種都能形成體細(xì)胞胚。在有些植物任何部分都可以得到體細(xì)胞胚，如胡蘿卜和毛茛上。迅