細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

1、淺談細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),陳巧玲2017-9-17,主要內(nèi)容,細(xì)胞培養(yǎng)前的準(zhǔn)備細(xì)胞的原代培養(yǎng)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)細(xì)胞凍存與復(fù)蘇培養(yǎng)細(xì)胞的污染,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,離心機(jī),櫥柜,實驗臺,冰箱,培養(yǎng)箱,試劑柜,實驗儀器臺,超凈工作臺,實驗臺,,實驗臺,實驗臺,實驗臺,,水池,冰箱,衣柜,實驗臺,顯微鏡,遞物窗,緩沖間,無菌操作室,準(zhǔn)備室,,,,,,1.細(xì)胞培養(yǎng)室設(shè)置,一、細(xì)胞培養(yǎng)前的實驗準(zhǔn)備,,,,,,,,下風(fēng)口,上風(fēng)口,無

2、菌操作室,超凈工作臺和CO2培養(yǎng)箱,2.細(xì)胞培養(yǎng)的主要實驗設(shè)備,超凈工作臺的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動空氣通過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。,CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37 ℃ ，5％CO2 使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時應(yīng)注意的問題：①用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時，需將瓶蓋微松，以保證通氣。②保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒③箱內(nèi)蒸餾水槽中預(yù)留滅菌蒸餾水，以保持箱內(nèi)濕度，避免培養(yǎng)

3、液蒸發(fā)。,解剖顯微鏡,倒置顯微鏡,2.細(xì)胞培養(yǎng)的主要實驗設(shè)備,血清（天然成分）：,基礎(chǔ)培養(yǎng)基（人工合成）：干粉培養(yǎng)基DMEM 、α-MEM、RPMI1640,水：高純度的去離子水,3.細(xì)胞培養(yǎng)的主要試劑（培養(yǎng)基）,,抗菌素：通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用，使用濃度為100U/ml,,消化液：常用0.25％胰蛋白酶，使細(xì)胞脫離組織或容器壁， 用含血清培養(yǎng)液中止其活性,4.細(xì)胞培養(yǎng)用器皿的清洗和消毒,? 一般玻璃器皿的清洗分為

4、四個步驟：1、自來水浸泡2、洗滌劑刷洗(如有必要進(jìn)行超聲處理）3、泡酸（濃硫酸、重鉻酸鉀及蒸餾水）4、流水沖洗過夜，依次用蒸餾水、三蒸水漂洗，最后烘干備用,常用消毒方法：1、濕熱滅菌法（高壓蒸汽滅菌），15磅，15～20min2、過濾除菌(如：血清的除菌）,細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture)是指細(xì)胞的離體培養(yǎng)，是在無菌條件下，把動物或植物的細(xì)胞從機(jī)體中分離出來，置于培養(yǎng)皿中，并在一個合適的環(huán)境中，給以營養(yǎng)物質(zhì)，使之繼續(xù)生存

5、和繁殖的方法。,細(xì)胞培養(yǎng)（Cell Culture）,,細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念,培養(yǎng)細(xì)胞的類型,貼附型成纖維樣細(xì)胞型上皮樣細(xì)胞型 懸浮型,,細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念,培養(yǎng)人真皮成纖維細(xì)胞,培養(yǎng)人口腔上皮細(xì)胞,培養(yǎng)的骨髓瘤細(xì)胞,貼附型細(xì)胞的生長特性,細(xì)胞的貼壁生長 接觸抑制 細(xì)胞的生長曲線,細(xì)胞貼壁延展過程(模式圖),,細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念,細(xì)胞的接觸抑制現(xiàn)象,正常培養(yǎng)細(xì)胞的生長曲線,,,,,,,,,,,,,,,退化死亡,平臺期,細(xì)胞數(shù)

6、增大極限點，出現(xiàn)接觸抑制,細(xì)胞指數(shù)生長極限點,指數(shù)生長期,潛伏期,細(xì)胞數(shù)量,0,24,48,72,96,120,小時,指數(shù)生長期是最佳實驗期 !,原代培養(yǎng)，或稱為初代培養(yǎng)，就是從供體取下組織細(xì)胞后在體外進(jìn)行的首次培養(yǎng)，中途不分割培養(yǎng)物。常用的原代培養(yǎng)方法有組織塊培養(yǎng)法和消化培養(yǎng)法。,二、原代培養(yǎng),,實驗準(zhǔn)備 取材、分離細(xì)胞 原代培養(yǎng) 維護(hù)培養(yǎng),,小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng),著裝,操作者進(jìn)入無菌室前先用肥皂洗凈雙手，然后用1‰ 新

7、潔爾滅浸泡消毒5分鐘,原代培養(yǎng)的一般流程,原代培養(yǎng)的一般流程,,小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng),將小白鼠斷頸處死，然后用75%酒精或1‰ 新潔爾滅浸泡消毒，迅速進(jìn)入無菌室。,用眼科剪和鑷，將腎外膜剪破，并將其剝向腎門，去腎外膜及脂肪,實驗準(zhǔn)備 取材、分離細(xì)胞 原代培養(yǎng) 維護(hù)培養(yǎng),實驗準(zhǔn)備 取材、分離細(xì)胞 原代培養(yǎng) 維護(hù)培養(yǎng),,小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng),原代培養(yǎng)的一般流程,組織塊培養(yǎng)法,原代培養(yǎng)方法,消化法,,,,,原代培養(yǎng)

8、流程圖：組織塊法,原代培養(yǎng)流程圖：組織塊法,原代培養(yǎng)流程圖：消化法,原代培養(yǎng)流程圖：半消化法,小鼠胚胎成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng),三、傳代培養(yǎng),傳代培養(yǎng)，在原代培養(yǎng)物鋪展為單細(xì)胞層后，將原代培養(yǎng)細(xì)胞分開接種到兩個或多個新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)增殖。,,,,,細(xì)胞的傳代培養(yǎng),將原代培養(yǎng)物分割后重新接種到兩個或多個培養(yǎng)瓶內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，這一操作稱為傳代培養(yǎng),傳代比例為1:3 至1:6，依細(xì)胞種類而異.細(xì)胞傳代培養(yǎng)的意義傳代時機(jī)的把握傳代培養(yǎng)的代數(shù)限制

9、；少數(shù)細(xì)胞可出現(xiàn)永生化,吸去舊液,,加入消化液解離細(xì)胞約5min,,在倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈圓粒狀,,,細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：貼附型,PBS洗 滌1~2次,,吹打懸浮細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度,分裝接種，置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),,在培養(yǎng)瓶中加入適量含血清培養(yǎng)液,,,培養(yǎng)細(xì)胞的觀察,細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：貼附型,培養(yǎng)細(xì)胞的觀察,,培養(yǎng)液顏色、是否清亮,培養(yǎng)細(xì)胞的狀態(tài),細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：貼附型,吸去舊液,,加入消化液解離細(xì)胞約5min,,在

10、倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈圓粒狀,,,PBS洗 滌1~2次,,吹打懸浮細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度,分裝接種，置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),,在培養(yǎng)瓶中加入適量含血清培養(yǎng)液,,,培養(yǎng)細(xì)胞的觀察,吸去舊液,,加入消化液解離細(xì)胞約5min,,在倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈圓粒狀,,,細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：貼附型,PBS洗 滌1~2次,,吹打懸浮細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度,分裝接種，置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),,在培養(yǎng)瓶中加入適量含血清培養(yǎng)液,,,培養(yǎng)細(xì)

11、胞的觀察,中止消化、吹散細(xì)胞,離心，收集細(xì)胞,細(xì)胞計數(shù)，調(diào)節(jié)密度,按比例分割，接種至新培養(yǎng)瓶,細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：懸浮型,四、細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇,細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞間的常規(guī)工作。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少人力、減少經(jīng)費、減少污染、減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化，最大限度的保存細(xì)胞活力。,細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的原則：慢凍快融,低溫保護(hù)劑的應(yīng)用,細(xì)胞凍存方法,程序降溫儀,細(xì)胞凍存盒,,,,五、培養(yǎng)細(xì)胞的污染,所有混入培養(yǎng)環(huán)境中對細(xì)胞生存有害的成分