豬克隆胚胎生產技術及組蛋白乙?；庖邿晒馊旧夹g優(yōu)化.pdf

1、豬的體細胞核移植（克隆）技術在畜牧業(yè)生產、人類醫(yī)學、基礎研究等方面都有非常重要的應用價值。但是，目前豬的體細胞克隆操作要求復雜、效率低、成本高，極大地限制了該技術的推廣。為建立一種經濟、有效、方便而穩(wěn)定的豬體細胞克隆胚生產技術體系，以及為將來揭示豬克隆胚胎發(fā)育表觀遺傳修飾調控機理研究奠定基礎。本研究開展了如下試驗：
　　 試驗一：探索了肺氣對豬卵母細胞體外成熟及后續(xù)孤雌和克隆胚胎早期發(fā)育能力的影響。豬卵母細胞隨機分布在三組氣相環(huán)

2、境下(lung air；5％O2;20％O2)，經體外成熟后檢測其細胞核成熟情況及后續(xù)孤雌和克隆胚胎發(fā)育能力。結果發(fā)現：使用肺氣成熟的豬卵母細胞在核成熟率(66.5％vs.60.2％，63.2％)及后續(xù)孤雌胚胎卵裂率(94.8％vs.94.2％，85.2％)、囊胚率(39.5％vs.40.3％，32.5％)、囊胚細胞總數(37vs.38，32)與低氧(5％O2)、高氧(20％O2)差異不顯著。此外，豬克隆胚胎卵裂率(88.3％vs.80

3、.3％)、囊胚率(7.3％vs．10.7％)和囊胚細胞數(34vs.36)與高氧(20％O2)也差異不顯著。結果表明：人體呼出的肺氣可以安全、有效地成熟豬卵母細胞。
　　 試驗二：比較了三組氣相環(huán)境下(5％O2;20％O2;lung air)培養(yǎng)豬無透明帶孤雌胚胎早期發(fā)育效率。豬卵母細胞透明帶經消化去除后，施以43V，80μs，，1次的電激活后，將無透明帶的卵母細胞培養(yǎng)在WOW(wells of well，WOW)中，觀察其體外

4、發(fā)育情況。結果發(fā)現：低氧(5％O2)和高氧(20％O2)之間的卵裂率、囊胚率、囊胚細胞數均差異不顯著，但囊胚率和囊胚細胞數明顯高于肺氣組(lung air)。結果表明：使用肺氣培養(yǎng)豬無透明帶孤雌激活胚胎可能沒有低氧(5％O2)和高氧(20％O2)效果好。
　　 試驗三：研究了化學半限定培養(yǎng)基和化學限定培養(yǎng)基對豬孤雌和克隆胚胎早期發(fā)育的影響。豬孤雌胚胎和克隆胚胎分別隨機分布在PZM-3、PZM-4、PZM-5三種培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察

5、和分析其卵裂、囊胚和囊胚細胞數的情況。結果如下：對孤雌胚胎而言，三組培養(yǎng)基之間的卵裂率差異不顯著(P＞0.05)，PZM-3中囊胚率顯著高于PZM-4和PZM-5(78.9％vs.36.0％，52.3％)（P＜0.05），并且囊胚細胞數PZM-3組明顯高于PZM-5，但與PZM-4相似。就克隆胚胎而言，三組培養(yǎng)基之間的卵裂率和囊胚率均差異不顯著CP＞0.05），但囊胚細胞數PZM-3組明顯高于PZM-5，并且與PZM-4組相似。上述結果

6、表明：化學半限定培養(yǎng)基PZM-3和化學限定培養(yǎng)基PZM-4能夠有效地支持豬PA和SCNT胚胎的發(fā)育。
　　 試驗四：比較了不同融合激活方法對豬無透明帶克隆胚胎體外發(fā)育能力的影響。豬無透明帶克隆胚胎經一步法的融合同時激活方案和兩步法的融合后延遲激活方案，激活后培養(yǎng)于WOW中觀察兩種激活策略的克隆胚胎早期發(fā)育情況。結果發(fā)現：兩種融合激活方案之間的卵裂率、囊胚率及囊胚細胞數均差異不顯著(P＞0.05)。但融合后延遲激活方案的囊胚率有高

7、于融合同時激活的趨勢。結果表明：融合同時激活和融合后延遲激活都能夠有效地激活豬克隆胚胎，但融合后延遲激活的效果更好些。
　　 試驗五：研究了不同卵胞質數量對豬無透明帶克隆胚胎體外發(fā)育能力的影響。將1枚卵胞質和2枚卵胞質構建的無透明帶豬重構胚，經融合后延遲激活方案處理后培養(yǎng)于WOW中觀察和分析兩組的克隆胚胎早期發(fā)育能力。結果發(fā)現：兩枚卵胞質構建的克隆胚胎在卵裂率(92.1％vs.74.8％)、囊胚率(21.5％vs．9.5％)及囊

8、胚細胞數(49vs.30)方面均顯著高于對照組1枚卵胞質構建的克隆胚胎(P＜0.05)。結果表明：增加去核卵細胞質的數量或體積能夠提高豬克隆胚胎早期發(fā)育效率和囊胚發(fā)育質量。
　　 試驗六：豬孤雌胚胎和胎兒成纖維細胞免疫熒光染色技術優(yōu)化研究。結果發(fā)現：進口二抗、胚胎固定時間15min和透化時間20～30min，有透明帶可以明顯提高染色照片的清晰度并降低背景色。而不同代數豬胎兒成纖維細胞染色效果差異不明顯。結果表明：使用進口二抗、胚