梨S-Rnase基因啟動子克隆及雌雄不育植物表達載體構建.pdf

1、我國楊樹天然林約300萬公頃,人工林約700萬公頃,柳樹、懸鈴木、樟樹等園林綠化樹種也分布幾乎遍及全國,大量植源性污染如飛毛飛絮、果毛、紫黑色漿果等對環(huán)境產(chǎn)生了極大的污染,也對人體健康如皮膚過敏、鼻塞、流涕、咳嗽、甚至引發(fā)哮喘、過敏性鼻炎等造成嚴重的影響。減輕植源性飛毛飛絮污染的有效途徑之一是利用基因工程手段來培育雄性不育、雌性不育或雌雄均不育的楊柳樹、懸鈴木、樟樹等園林綠化樹種新品種,其中雄性不育不能完全有效控制植源性污染,而雌性不育

2、及雌雄均不育園林綠化樹種因不產(chǎn)生花粉、種子或果實,即可有效控制植源性污染。梨雌蕊S-RNase基因在雌蕊中特異表達,其啟動子為雌蕊特異表達啟動子。為了解決上述飛毛飛絮污染問題,本研究對雌蕊特異表達S-RNase基因啟動子進行克隆,并此基礎上構建了雌性不育植物表達載體和雌雄不育植物表達載體,為培育雌性不育或雌雄均不育園林綠化樹種提供了有用的分子工具。主要研究結(jié)果如下:
　　 1、采用TAIL-PCR擴增梨S12-、S13-、S21

3、-RNase基因5’端上游側(cè)翼序列,長度分別為1448bp,854bp,1137bp,分別命名為PpS12pro(HM047239)、PpS13pro(HM047240)、PbS21pro(HM047241)。PLACE和PlantCARE對其進行順式調(diào)控元件預測發(fā)現(xiàn),三個5’端上游側(cè)翼序列均具有典型TATA box和CAAT box,且上游均存在光應答調(diào)控元件(Box4,G-box)、脫落酸應答元件ABRE及水楊酸應答元件TCA-el

4、ement等。根據(jù)砂梨S12-RNase基因5’端上游側(cè)翼序列調(diào)控元件設計一系列5’端缺失片段,并連接到pBI101.2載體的SalⅠ與XbaⅠ酶切位點之間與GUS基因融合,成功構建了6個S12-RNase基因啟動子植物表達載體PpS12pro-0-pBI101.2～PpS12pro-5-pBI101.2,Floral Dip法轉(zhuǎn)化哥倫比亞野生型擬南芥,卡那霉素抗性平板篩選并PCR檢測分別得到了4、48、17、19、10、19株陽性轉(zhuǎn)基

5、因植株及2、13、8、10、7、12株轉(zhuǎn)基因純合體植株,用于進一步驗證該啟動子的表達功能。
　　 2、利用花椰菜品種‘綠嶺’基因組DNA克隆了花藥絨氈層特異BoA9基因啟動子和類細胞毒素用途的半胱氨酸蛋白酶基因CysP1。以PpSlepro-pBI101.2為基礎,在砂梨S12-RNase基因啟動子下游XbaⅠ與XmaⅠ酶切位點之間插入半胱氨酸蛋白酶基因CysP1,構建了雌性不育植物表達載體PpS12pro-CysP1-pBI1