中國(guó)小麥花葉病毒侵染性克隆構(gòu)建及其與宿主HSP70互作研究.pdf

1、上個(gè)世紀(jì)末，本實(shí)驗(yàn)室在我國(guó)山東冬小麥上鑒定了一種由禾谷多粘菌傳播的新病毒，命名為中國(guó)小麥花葉病毒(Chinese wheat mosaic virus，CWMV)，它能引起小麥花葉病，導(dǎo)致小麥（Triticum aestivum）嚴(yán)重減產(chǎn)。盡管目前在CWMV的生物學(xué)和分子生物學(xué)有了明顯的進(jìn)展，但在其反向遺傳學(xué)及其與宿主相互作用等領(lǐng)域尚存在大量的研究空白。熱休克蛋白70(Heat shock protein70，HSP70)是生物體內(nèi)高度

2、保守的一種分子伴侶蛋白，在多種細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮重要作用，也是參與多種病毒侵染過(guò)程的重要因子。因此，本研究首先圍繞CWMV cDNA克隆構(gòu)建及其侵染活性進(jìn)行了探索，然后基于CWMV侵染性克隆分析了CWMV與宿主HSP70的互作關(guān)系，并取得了以下結(jié)果:
　　首先，構(gòu)建了T7啟動(dòng)子控制下的CWMV全長(zhǎng)cDNA克隆，經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄、摩擦接種小麥后通過(guò)Northern blot、Western blot、電鏡觀察、癥狀等實(shí)驗(yàn)，分析了該克隆的侵染活

3、性。在此基礎(chǔ)上，又構(gòu)建了35S啟動(dòng)子控制下的CWMV全長(zhǎng)cDNA克隆雙元載體，并采用農(nóng)桿菌浸潤(rùn)法接種本氏煙，實(shí)驗(yàn)分析表明該克隆能夠通過(guò)農(nóng)桿菌浸潤(rùn)法高效地侵染本氏煙，這為開(kāi)展CWMV的反向遺傳學(xué)奠定了基礎(chǔ)。
　　然后，基于CWMV侵染性克隆分析了CWMV和宿主HSP70之間的關(guān)系。通過(guò)qRT-PCR和Western-blot等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在CWMV侵染的宿主小麥和模式植物本氏煙中HSP70較為豐富，表明CWMV侵染影響宿主HSP70的

4、表達(dá)。通過(guò)Quercetin藥物處理和VIGS技術(shù)抑制HSP70表達(dá)，能降低CWMV RNA的積累;而過(guò)表達(dá)HSP70時(shí)，則增加CWMV RNA的積累，該結(jié)果表明HSP70能影響CWMV的復(fù)制。酵母雙雜交試驗(yàn)(YTH)、BiFC、共定位等實(shí)驗(yàn)表明，CWMV編碼的復(fù)制酶與宿主HSP70蛋白在體內(nèi)外發(fā)生相互作用，而且互作的關(guān)鍵區(qū)域是位于CWMV復(fù)制酶的167-333aa區(qū)域。在植物細(xì)胞內(nèi)，HSP70和CWMV復(fù)制酶能夠互作并形成類(lèi)似包涵體的