苧麻花葉病毒編碼NSP與寄主RBCS1的互作研究.pdf

1、苧麻花葉病毒(RaMoV)是雙生病毒科(Geminiviridae)菜豆花葉病毒屬(Begomovirus)的雙組份雙生病毒,在自然界以RaMoVA／RaMoVB病害復(fù)合體的形式侵染寄主。至今已在湖南、江蘇和浙江的苧麻及福建的普通煙草上檢測到該種病毒。本文所用毒源RaMoV F3分離物是從福州田間表現(xiàn)出矮化、卷葉和脈腫的普通煙草上分離得到病毒。
　　 雙組份雙生病毒在寄主植物細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)動(dòng)依賴于DNA-B組分BV1編碼的核穿梭蛋白

2、(NSP)和BC1編碼的運(yùn)動(dòng)蛋白(MP)。因此,制備NSP的多克隆抗體對(duì)于研究病毒在寄主內(nèi)的侵染和運(yùn)動(dòng)機(jī)制具有重要意義。本文經(jīng)克隆RaMoV的BV1基因、利用pET-28a(+)構(gòu)建表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化原核表達(dá)細(xì)胞.Escherichia coli BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)表達(dá)NSP,將此蛋白割膠研磨后,免疫新西蘭白兔,制備了抗NSP的多克隆抗體。ELISA檢測抗體的滴度為1:32000,Western blotting結(jié)果顯示該抗體

3、能與NSP發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。
　　 在本氏煙中,通過PVX異源載體和瞬時(shí)表達(dá)技術(shù),進(jìn)行了RaMoV編碼蛋白的致病性研究。結(jié)果表明,A組分AV2編碼的蛋白和B組分BV1編碼的NSP為致病因子,接種PVX-AV2和PVX-BV1植株的新生葉分別在第10天和第13天出現(xiàn)壞死癥狀,逐漸枯萎死掉,接種PVX-AC4的植株在第8天出現(xiàn)明顯的花葉表型,而PVX-AC2和PVX-BC1及其所有基因的相應(yīng)突變體在系統(tǒng)葉上只出現(xiàn)了輕微的花葉和曲葉

4、癥狀,與單獨(dú)接種PVX表現(xiàn)的癥狀相似。取系統(tǒng)葉片提取RNA,以PVX的CP基因?yàn)樘结?Northern blotting結(jié)果顯示,接種PVX-AV2的植株體內(nèi)PVX的復(fù)制量較對(duì)照植株多,而表達(dá)NSP植株的PVX積累量沒有明顯變化。結(jié)果說明AV2和BV1編碼的蛋白在RaMoV侵染寄主的過程中發(fā)揮重要的作用,可能是病毒能夠順利“逃脫”寄主防衛(wèi)系統(tǒng)的關(guān)鍵因子,從而使病毒在寄主體內(nèi)順利進(jìn)行系統(tǒng)侵染。激光共聚焦顯微鏡觀察RaMoV DNA-B組分

5、編碼的蛋白的亞細(xì)胞定位情況,發(fā)現(xiàn)BV1編碼的NSP定位在細(xì)胞核中,而BC1編碼的NIP主要定位在細(xì)胞質(zhì)中。
　　 利用酵母雙雜交技術(shù)研究了RaMoV的NSP和中國大青黃色花葉病毒(C1YMCNV)的NSP與寄主本氏煙1,5-二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶小亞基(RBCS1)的互作關(guān)系。提取本氏煙的總RNA,進(jìn)行RT-PCR,克隆RBCS1基因,將RBCS1與BV1分別構(gòu)建到酵母表達(dá)載體pGAD-T7和pGBK-T7獲得重組載體pGA

6、D-RBCS1和pGBK-BV1,將質(zhì)粒pGAD-RBCS1和pGBK-BV1共轉(zhuǎn)化到酵母菌AH109,通過不同的營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基進(jìn)行篩選,研究兩者間的互作關(guān)系。結(jié)果表明RaMoV和C1YMCNV的NSP都可以與本氏煙RBCS1互作。雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)表明,NSP與本氏煙RBCS1的互作主要發(fā)生在煙草葉片細(xì)胞的細(xì)胞核里。
　　 Real time PCR檢測表明,RaMoV侵染本氏煙能夠使RBCS1的表達(dá)量下調(diào)55％左右。借助于

7、pTRV誘導(dǎo)的沉默技術(shù),將RBCS1基因沉默后接種RaMoV的侵染性克隆。提取基因組DNA,Southern blotting顯示沉默RBCS1后,RaMoV的復(fù)制量明顯增加。經(jīng)DNA電泳,可在2700bp處看到一清晰條帶,經(jīng)測序分析后確定為RaMoV的病毒基因組,而對(duì)照的植物中沒有出現(xiàn)這一大小的條帶,說明RBCS1在病毒侵染過程中發(fā)揮重要的作用。為研究沉默RBCS1后,其它病毒侵染本氏煙的情況,接種PVX-GFP12天后,手提式紫外燈