三個棉花生長素信號轉(zhuǎn)導途徑相關基因的克隆與鑒定.pdf

1、棉花種植廣泛，是關系國計民生的重要物資，在國民經(jīng)濟發(fā)展中具有重要地位。由于生長素在植物生長發(fā)育和生理反應的過程中起著重要的調(diào)控作用，生長素可以調(diào)控細胞的伸長、分裂和分化，以及植物的頂端優(yōu)勢、不定根的形成、植物的向性反應、果實的發(fā)育、和胚的形成等方面。因此，研究棉花生長素信號轉(zhuǎn)導過程以及轉(zhuǎn)導途徑中的重要元件具有重要意義，同時研究棉花生長素信號轉(zhuǎn)導相關的基因的生物學功能，對全面了解生長素在棉花的生長發(fā)育以及形態(tài)建成過程中所發(fā)揮的作用，以及闡

2、明棉花中生長素信號轉(zhuǎn)導的復雜分子機制具有重要的理論意義。已有的研究成果表明，生長素調(diào)控的過程更多是通過調(diào)控其它基因表達來影響植物的發(fā)育和其他的一些反應，這些被調(diào)控的基因稱為生長素誘導的原初表達基因，能夠被生長素誘導繼而快速、特異、并且在不需要新的蛋白質(zhì)生物合成的條件下表達。原初反應基因包括Aux/IAAs( auxin/indoleacetis acids proteins)、SAURs(small auxin-up RNA)和GH3等

3、三類主要的轉(zhuǎn)錄因子家族。
　　 本研究利用cDNA芯片技術在棉纖維發(fā)育開花后5天(5DPA)、10天(10DPA)、15天(15DPA)、20天(20DPA)、25天(25DPA)篩選陸地棉標準系TM-1和優(yōu)質(zhì)抗病品種海島棉7124的差異表達基因，克隆得到與棉花生長素信號轉(zhuǎn)導途徑相關的3個重要cDNA克隆，并通過Real-Time PCR( Q-PCR)驗證了基因表達：
　　 (1)生長素結(jié)合蛋白ABP(auxin-bi

4、nding protein, GhABP)（GenB ank登錄號：AAO92740）該cDNA克隆插入片段長度為897bp，開放讀碼框長度為618bp，編碼206個氨基酸；(2)兩個生長素原初反應基因(primary auxin responsive genes)，一個屬于其中的生長素/吲哚乙酸蛋白( auxin/indoleacetis acids proteins, Aux/IAAs)超家族成員，該cDNA克隆插入片段長度為101

5、4bp，開放讀碼框長度為726bp，編碼242個氨基酸，Blastx比對與擬南芥(Arabidopsis thaliana)、蓖麻(Ricinus communis)、番薯（Ipomoeanil）等物種的IAA16都有一定相似度，因此將其命名為GhIAA16a;另一個屬于生長素原初反應基因其中的SAURs( small auxin-up RNAs)轉(zhuǎn)錄因子家族，該cDNA克隆插入片段長度為794bp，開放讀碼框長度為366bp，編碼12

6、2個氨基酸，Blastx比對與擬南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米（Zea mays）等物種的SAUR基因具有一定的相似性，因此將該基因命名為GhSAUR2。
　　 采用SignalP程序?qū)@三個基因進行了N端信號肽預測，GhSAUR2、GhIAA16a均無信號肽結(jié)構(gòu)，只有GhABP具有典型的信號肽，說明只有GhABP為分泌蛋白。并且對這三個基因進行了保守區(qū)域分析等。
　　 采用實時熒光定量PCR方法

7、(Real-time quantitative PCR)驗證各基因的表達，結(jié)果與芯片基本一致。其中GhABP與GhIAA16a表達趨勢相反，在棉纖維細胞伸長期（開花后10天）GhABP高量表達，而GhIAA16a表達量達最低，10天以后到25天GhABP表達量逐漸下降而GhIAA16a逐漸上升。說明GhABP基因可能是促進棉纖維發(fā)育，而GhIAA16a則和抑制棉纖維發(fā)育有關。
　　 利用本實驗室陸地棉遺傳標準系TM-1和海島棉7

8、124培育的140個BC1作圖群體分別對這三個基因進行染色體定位，GhABP、GhIAA16a定位到11號染色體，GhSAUR2定位到第8號染色體。
　　 對GhABP、GhIAA16a、與GhSAUR2基因分別構(gòu)建了GFP載體，然后利用基因槍法轟擊洋蔥表皮，亞細胞定位結(jié)果顯示GhABP定位于細胞膜上，GhIAA16a基因定位于細胞核上。
　　 對GhABP、GhIAA16a與GhSAUR2基因分別構(gòu)建了pBI121-3