棉花三個SAUR基因的克隆及其功能分析.pdf

1、棉花纖維是棉花胚珠表皮層發(fā)育成的單細胞毛狀體，其發(fā)育過程是由多種基因共同作用，受到轉(zhuǎn)錄、翻譯、代謝、激素等不同水平、不同因子共同調(diào)控的復雜的生物過程。其中植物激素對纖維起始和伸長起重要作用。生長素主要通過誘導生長素響應(yīng)基因表達起促進細胞伸長作用。棉花纖維發(fā)育伸長期是影響棉花纖維產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵時期，鑒定和利用纖維伸長相關(guān)的基因?qū)τ诮馕雒藁ɡw維發(fā)育的分子機理以及提高纖維產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要的理論和實踐意義。
　　李氏短絨棉突變體(Li

2、-1)是一個單基因顯性突變體，其棉絨不正常發(fā)育形成短絨。0-2 DPA(day post anthesis)的纖維起始和伸長及纖維次生壁沉積均正常，但3 DPA的纖維開始發(fā)生畸形，所以是研究纖維伸長和次生壁合成的理想材料。本實驗室前期用Microarray實驗對Li-1及野生型近等基因系TM-1的0 DPA胚珠及3 DPA和6 DPA纖維基因表達譜進行差異表達分析，發(fā)現(xiàn)生長素在棉花纖維伸長發(fā)育中起重要作用，并鑒定出3個在Li-1纖維中下

3、調(diào)表達的SAUR(SmallAuxin Up-regulated RNAs)基因。它們分別與擬南芥AtSA UR68(或AtSAUR67)和兩個編碼SAUR類似蛋白基因(分別為AT1G75590和AT2G46690)相似度最高，故暫將這3個基因分別命名為GhSA UR68、GhSA UR-like1和GhSA UR-like2。本研究克隆了這3個基因，進行時空表達特征分析和亞細胞定位分析。采用農(nóng)桿菌介導法分別轉(zhuǎn)化擬南芥和棉花，獲得GhS

4、A UR68基因和GhSA UR-like2基因過表達的轉(zhuǎn)基因擬南芥T0代，初步分析了這3個基因的功能。研究結(jié)果如下:
　　1、根據(jù)3個基因的Unigene(探針號GhiAffx.24789.1.S1_at、Ghi.5859.1.A1_s_at和Ghi.5444.1.S1_at)序列，克隆了基因的全長cDNA。其中，GhSA_UR68的cDNA全長為553bp，ORF全長為444bp，編碼148個氨基酸，分子量為36.42 kDa

5、; GhSAUR-like1的cDNA全長為638bp，ORF全長為474bp，編碼158個氨基酸，分子量為39.34 kDa; GhSA UR-like2的cDNA全長為747bp，ORF全長為369bp，編碼123個氨基酸，分子量為29.95 kDa，均為小分子蛋白。
　　2、利用實時熒光定量PCR技術(shù)對GhSAUR68、GhSAUR-like1和GhSAUR-like2進行時空表達分析，結(jié)果顯示3個基因在胚珠和纖維中表達量均

6、顯著高于根、莖、葉，且在TM-1中的表達量比在Li-1中高。在Li-1的6 DPA、10 DPA和20 DPA纖維中表達量明顯低于TM-1，說明這3個棉花SAUR基因可能在纖維伸長和次生壁加厚發(fā)育時期發(fā)揮作用。
　　3、用基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細胞進行瞬時表達實驗，結(jié)果為GhSAUR68定位在細胞膜和細胞核;GhSAUR-like1定位在細胞膜和細胞核;GhSAUR-like2定位在細胞核。3個基因均定位于細胞核，說明這3個基因可處

7、于生長素信號通路的下游，GhSAUR68和GhSAUR-like1還同時定位于細胞膜，說明它們還可能作用于其他信號通路過程。
　　4、將3個棉花SAUR基因ORF全長構(gòu)建到35S-pBI121表達載體，用農(nóng)桿菌泡花法將它們導入擬南芥。GhSA UR68轉(zhuǎn)基因苗中有62.5％心葉不生長或白化，植株表現(xiàn)正常的占37.5％，經(jīng)過卡那霉素(Kan+)抗性篩選及PCR檢測，獲得了轉(zhuǎn)GhSAUR68基因擬南芥18株陽性植株GUS染色結(jié)果顯示G

8、hSA UR68在根和老葉中特異表達。轉(zhuǎn)基因植株生長緩慢、生育期推遲及葉片有早衰現(xiàn)象，并且葉片表皮毛狀體凸起比野生型明顯。經(jīng)過卡那霉素抗性篩選及PCR檢測，獲得了轉(zhuǎn)GhSA UR-like基因擬南芥5株陽性植株。與野生型相比，GhSA UR-like2轉(zhuǎn)基因苗根長變短、側(cè)根數(shù)目增加，也出現(xiàn)不長心葉的現(xiàn)象，但葉片表皮毛狀體輕微減少。以上結(jié)果表明G hSA UR68在擬南芥中過表達影響擬南芥生育期及葉片正常生長卻可能促進毛狀體發(fā)育;GhSA

9、 UR-like過表達對植物生長發(fā)育作用不明顯，但可能不利于毛狀體生長發(fā)育。
　　5、觀察GhSA UR68和GhSA UR-like2擬南芥同源基因AtSAUR68和AT2G46690的突變體表型及其對生長素(IAA)和赤霉素(GA3)處理的響應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常培養(yǎng)條件下這兩個突變體根長均比野生型的短。5μMLAA處理條件下，兩種突變體和野生型的根及下胚軸發(fā)育均受到抑制。0.5μM GA3處理對兩種突變體和野生型生長的影響均不明顯