犬細(xì)小病毒VP2基因的克隆、表達(dá)及其重組蛋白的抗原性研究.pdf

1、犬細(xì)小病毒感染是由犬細(xì)小病毒（Canine parvovirus，CPV）引起的一種高度接觸性傳染病。其傳播速度快，發(fā)病率和死亡率高，對(duì)家犬、經(jīng)濟(jì)動(dòng)物及野生動(dòng)物危害很大。目前，該病尚無有效的治療方法。對(duì)其防治主要以弱毒疫苗免疫預(yù)防為主，但弱毒疫苗在使用過程中存在不安全問題，因此，急需一種安全有效的新型疫苗來預(yù)防該疾病。由于CPV的主要抗原位點(diǎn)位于VP2蛋白上，因此，VP2基因及其編碼蛋白已成為研究犬細(xì)小病毒的熱點(diǎn)。本研究工作主要包括以下

2、四部分：
　　 1．犬細(xì)小病毒巢式PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用
　　 從臨床上疑似感染CPV的犬糞便中提取總DNA。根據(jù)GenBank已發(fā)表的CPV特異保守的VP2基因序列設(shè)計(jì)二對(duì)引物，擴(kuò)增出目的條帶，進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果表明與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的CPV VP2基因序列的同源性為99.3~100%。通過摸索重復(fù)性、特異性、敏感性試驗(yàn)，建立了巢式PCR方法。此方法具有良好的特異性和敏感性，適合于犬細(xì)小病毒的檢測(cè)和分子流行病學(xué)調(diào)查。
　

3、　 2．犬細(xì)小病毒VP2基因的克隆及序列分析
　　 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的犬細(xì)小病毒基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，以巢式PCR檢測(cè)的陽性樣品DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增，獲得目的基因，將目的基因進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示，序列全長(zhǎng)為1755bp，其核苷酸與國(guó)外和中國(guó)各地區(qū)流行株的同源性較高，介于98.4~99.8%之間，表明本研究成功克隆了CPV VP2基因。
　　 3．犬細(xì)小病毒VP2基因的原核表達(dá)及免疫反應(yīng)性研究

4、>　　 成功構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-VP2，用克隆的CPV VP2基因轉(zhuǎn)化到E.coli BL21中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE和Western-Blotting分析，結(jié)果表明，誘導(dǎo)表達(dá)的pGEX-4T-VP2陽性菌株可表達(dá)出大小為90kDa蛋白，該重組蛋白具有反應(yīng)活性。
　　 4．犬細(xì)小病毒VP2基因的原核表達(dá)條件優(yōu)化和蛋白純化及免疫原性研究
　　 為了確定VP2基因蛋白在大腸桿菌E. Coli