伏馬菌素B1和黃曲霉毒素B1聯合誘導Vero細胞凋亡的研究.pdf

1、伏馬菌素是由串珠鐮刀菌產生的一種水溶性的霉菌毒素,其中FB1是伏馬菌素的主要組成部分,同時也是導致伏馬菌素毒性的主要原因。FB1廣泛存在于玉米及其制品中,對人類的健康以及畜牧業(yè)的發(fā)展構成了潛在的威脅。在體內、體外的研究中,FB1的毒性作用已經得以證實,包括肝、腎毒性,肺水腫,神經毒性,免疫抑制,以及致癌性等。研究表明FB1也具有較強的細胞毒性,但是目前關于FB1對細胞毒性研究的報道比較少,誘導細胞凋亡具體的信號轉導機制的報道也不多。同時

2、AFB1是由黃曲霉菌與寄生曲霉菌產生的一類次級代謝產物,也是目前已知的毒性最強的毒素,廣泛存在于各種谷物和飼料中,而且還有致突變作用和致DNA損傷的作用,AFB1還能夠引起誘發(fā)性肝癌,使肝臟廣泛出血、壞死,對腎臟也有明顯的損壞作用。鑒于兩種毒素都廣泛存在于各種谷物及其制品中,并且都能夠產生腎毒性,所以本試驗以FB1敏感細胞Vero細胞作為研究對象,經FB1和AFB1的單獨和聯合作用后,觀察對Vero細胞的形態(tài)學、細胞的活性、線粒體膜電位

3、以及凋亡時相關蛋白表達的變化的影響,探討兩種毒素誘導細胞凋亡的作用機制以及兩者的聯合作用,為深入研究FB1的毒性機理以及FB1誘導細胞凋亡的機制奠定了基礎。
　　 試驗一:
　　 本試驗將處于對數期生長的Vero細胞以不同濃度的FB1和AFB1,以及兩者的聯合濃度進行處理,并設置空白培養(yǎng)基作為對照組。24 h后,采用MTT法測定各濃度組毒素對Vero細胞的毒性作用；于倒置顯微鏡下觀察Vero細胞在形態(tài)學上的變化；用瓊脂糖

4、凝膠電泳來檢測其DNA的完整性。結果顯示:MTT法測定毒素對Vero細胞的增殖抑制率中,在作用時間相同的情況下,FB1和AFB1兩種毒素單獨作用時,隨著毒素濃度的加大,細胞的增值抑制率也逐漸增大；當FB1分別與AFB1的兩個濃度聯合時,FB1的細胞增殖抑制率比單獨時的抑制率都高,其IC50也顯著的降低。形態(tài)學上的變化顯示,FB1從2500 ng·mL-1開始對Vero細胞產生較明顯的凋亡作用,AFB115、30 ng·mL-1兩個濃度對

5、Vero細胞都具有誘導凋亡的作用,其中各濃度毒素組細胞的凋亡率都是顯著高于對照組的；瓊脂糖凝膠電泳后,各試驗組的細胞均形成DNA ladder,證明細胞的DNA發(fā)生了斷裂,引起了細胞的凋亡。
　　 試驗二:
　　 本試驗將處于對數期生長的Vero細胞以不同濃度的FB1和AFB1,以及兩者的聯合濃度進行處理,并設置空白培養(yǎng)基作為對照組。24h后,經JC-1染色后,用流式細胞儀來檢測線粒體膜電位的變化情況。結果顯示:線粒體膜

6、電位的檢測中,在作用時間相同的情況下,FB1單獨時,從濃度2500 ng·mL-1開始與對照組相比差異顯著,并且隨著FB1濃度的逐漸增大,線粒體膜電位的下降程度也越來越明顯,15 ng·mL-1 AFB1低濃度聯合組以及30 ng·mL-1 AFB1高濃度聯合組中線粒體膜電位的下降程度都比FB1單獨時下降的大。
　　 試驗三:
　　 本部分試驗采用免疫蛋白印跡(Western Blotting)檢測FB1和AFB1單獨和