黃曲霉毒素B1對(duì)肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的影響.pdf

1、目的：1、通過(guò)黃曲霉毒素B1(AFB1)處理肝癌細(xì)胞株SMMC-7721研究AFB1對(duì)SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)的影響2、探討黃曲霉菌毒素B1是否激活肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)的Ras-ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路3、葉綠酸對(duì)黃曲霉毒素B1是否具有抑制作用。
　　方法：1、首先應(yīng)用不同濃度的黃曲霉毒素B120ug/ml、10ug/ml、5ug/ml、2ug/ml、1.0ug/ml、0.1ug/ml、0.01ug/ml處理肝癌細(xì)胞株S

2、MMC-7721,MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,觀察黃曲霉毒素B1對(duì)肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。選擇AFB11.0ug/ml作為本實(shí)驗(yàn)的最佳實(shí)驗(yàn)濃度作進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。2、觀察AFB11.0ug/ml對(duì)肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞周期的影響,應(yīng)用AFB11.0ug/ml處理SMCC-7721細(xì)胞,37.0℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)后收集細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。3、觀察AFB1是否能夠快速激活SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)Ras

3、-MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,應(yīng)用AFB11.0ug/ml處理SMMC-7721細(xì)胞,37.0℃、5％CO2條件下培養(yǎng),分別于處理后0、30、60、90、120分鐘收集細(xì)胞并提取細(xì)胞蛋白質(zhì),選擇Ras、ERK1蛋白作為指標(biāo)應(yīng)用免疫印跡術(shù)檢測(cè)Ras、ERK1蛋白是否表達(dá)及其表達(dá)量有無(wú)改變,并以β-actin蛋白作為內(nèi)參蛋白。4、應(yīng)用不同濃度的葉綠酸50ug/ml、30ug/ml、20ug/ml、10ug/ml處理肝癌細(xì)胞株SMMC-7721,3

4、7.0℃、5％CO2條件下培養(yǎng),觀察葉綠酸對(duì)SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,選擇適宜濃度(20ug/ml、10ug/ml)的葉綠酸進(jìn)一步實(shí)驗(yàn),盡可能排除葉綠酸的對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。5、應(yīng)用不同濃度的葉綠酸20ug/ml、10ug/ml與AFB11.0ug/ml共同處理肝癌細(xì)胞株SMMC-7721,37.0℃、5％CO2條件下培養(yǎng),觀察葉綠酸對(duì)AFB1的作用,選擇對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯影響且能抑制AFB11.0ug/ml作用的葉綠酸20ug/m

5、l作為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的干預(yù)因素。6、應(yīng)用葉綠酸20ug/ml與AFB11.0ug/ml共同處理SMMC-7721細(xì)胞,37.0℃、5％CO2條件下培養(yǎng)。24小時(shí)后收集細(xì)胞,檢測(cè)肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞周期變化及凋亡情況。7、應(yīng)用葉綠酸20ug/ml與AFB11.0ug/ml共同處理SMMC-7721細(xì)胞,37.0℃、5％CO2條件下CO2孵育箱培養(yǎng)。分別于處理后0、30、60、90、120分鐘收集細(xì)胞提取細(xì)胞蛋白質(zhì),同樣選擇Ras、

6、ERK1蛋白作為指標(biāo)應(yīng)用免疫印跡術(shù)檢測(cè)Ras、ERK1蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：1、不同濃度的AFB1對(duì)肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的影響不同,AFB120.0ug/ml、AFB110.0ug/ml、AFB15.0ug/ml表現(xiàn)為細(xì)胞毒性,細(xì)胞不同程度死亡,并呈濃度依賴性;AFB11.0ug/ml、AFB10.1ug/ml、AFB10.01ug/ml對(duì)肝癌細(xì)胞株SMMC-7721具有促進(jìn)增殖的作用,以AFB11.0ug/ml濃度顯

7、著,AFB10.1ug/ml、AFB10.01ug/ml作用漸減弱。2、AFB11.0ug/ml處理SMMC-7721細(xì)胞后37.0℃、5％CO2條件下培養(yǎng)24小時(shí),S期細(xì)胞比對(duì)照組增加,G1期細(xì)胞比對(duì)照組減少。3、肝癌細(xì)胞株SMMC-7721表達(dá)Ras、ERK1蛋白。4、AFB11.0ug/ml處理SMMC7721細(xì)胞后90、120分鐘試驗(yàn)點(diǎn)比空白對(duì)照組Ras、ERK1蛋白表達(dá)量增加。5、葉綠酸處理細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)葉綠酸30ug/ml即可

8、誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞株SMMC-7721凋亡,20ug/ml、10ug/ml對(duì)肝癌細(xì)胞株SMMC-7721生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。6、葉綠酸與AFB11.0ug/ml共同作用于肝癌細(xì)胞株SMMC-7721,葉綠酸20ug/ml可抑制AFB1對(duì)肝癌細(xì)胞的促增殖作用;葉綠酸10ug/ml對(duì)AFB1作用無(wú)明顯影響。7、葉綠酸20ug/ml處理AFB11.0ug/ml作用下的肝癌細(xì)胞后37.0℃、5％CO2條件下培養(yǎng)24小時(shí),S期細(xì)胞比AFB1組減少8、葉綠酸

9、20ug/ml、AFB11.0ug/ml共同處理肝癌細(xì)胞株SMMC-7721,37.0℃、5％CO2條件下培養(yǎng),90、120分鐘試驗(yàn)點(diǎn)比AFB11.0ug/ml組Ras、ERK1蛋白表達(dá)量降低。
　　結(jié)論：1、黃曲霉毒素B1對(duì)肝癌細(xì)胞株SMMC-7721增殖活性具有增強(qiáng)作用2、黃曲霉毒素B1能夠活化人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721中的Ras-ERK通路并可能通過(guò)活化Ras-ERK通路干預(yù)細(xì)胞周期調(diào)控、促進(jìn)肝癌細(xì)胞株SMMC-7721