長期低鹽脅迫誘導凡納濱對蝦肝胰腺差異表達基因的分析和鑒定.pdf

1、凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)廣泛分布于太平洋沿岸水域秘魯北部至墨西哥桑諾拉一帶，以厄瓜多爾最為集中。作為一種廣鹽性的甲殼動物，凡納濱對蝦可以適應0.5～40的鹽度范圍。近年來，為了緩解海水養(yǎng)殖對沿海環(huán)境的污染并推進內陸鹽堿地區(qū)養(yǎng)殖的發(fā)展，淡化苗種在內陸的低鹽度養(yǎng)殖已經成為了水產養(yǎng)殖的一個重要發(fā)展方向，但極低鹽度下養(yǎng)殖的對蝦存在著三個突出問題：生長速度慢、成活率低、免疫力低，對病原菌易感性增高，以上存在的現實問題

2、制約了低鹽度養(yǎng)殖的推廣。開展長期低鹽養(yǎng)殖對凡納濱對蝦的分子機理研究，不但可以為進一步為甲殼動物生理調節(jié)提供一定的理論依據，也為進一步從分子生物學水平進行相關的研究建立分子水平的檢查平臺。本研究利用抑制消減雜交技術構建了長期低鹽誘導的凡納濱對蝦肝胰腺cDNA文庫，對文庫中拼接的序列進行了功能注釋和分類，初步探明了長期低鹽誘導后的凡納濱對蝦差異基因表達情況，并對篩選到的基因進行了長期不同低鹽下轉錄水平變化的探討，為從分子水平闡明長期脅迫機制

3、奠定了基礎。論文主要包括以下幾方面內容：
　　 1.首次利用SSH技術構建了長期低鹽誘導下凡納濱對蝦肝胰腺差異表達cDNA文庫。實驗用凡納濱對蝦初始體重為(0.27±0.01)g，飼養(yǎng)于鹽度2和30中56天，取樣后構建肝胰腺不同鹽度養(yǎng)殖下的消減cDNA文庫，隨機挑選200個(正向80個，反向120個)陽性克隆進行測序，成功獲得179個(正向64個，反向115個)ESTs序列，拼接后得到73個Unigenes，包括19個Conti

4、gs(正向7，反向12)和54個Singletons(正向19，反向35)。將正向文庫26條Unigenes和反向文庫的47條Unigenes分別用BlastX和BlastN程序與GenBank上的非冗余蛋白數據庫(nr)和非冗余核酸數據庫(nt)進行比對分析發(fā)現，75.34％的Unigenes(55/73)與公共數據庫中已知的基因具有同源性。生物學信息分析表明，這些Unigenes所代表的相應基因的功能包括免疫相關、代謝相關、核蛋白、

5、細胞凋亡和轉移蛋白。這些基因信息也表明凡納濱對蝦在長期低鹽脅迫誘導后，導致的生理變化非常復雜。文庫中排第一位的是免疫相關基因，占47.06％(8/17)，其中有5個來自反向文庫，即在長期低滲脅迫中，文庫中的62.5％免疫相關基因下調表達，以上結果為低滲脅迫和對蝦免疫力之間的關系提供了有利的間接證據，也為對蝦淡化養(yǎng)殖的免疫性能研究提供了研究方向。構建的差異表達cDNA文庫可較好的反映長期低鹽脅迫對凡納濱對蝦影響的基因信息，以上結果豐富了甲

6、殼動物環(huán)境脅迫研究的基因信息。
　　 2.在長期鹽度脅迫抑制性消減雜交文庫構建的基礎上，分析了反向文庫編碼血藍蛋白、蛻皮類固醇調節(jié)蛋白、幾丁質酶、胰凝乳蛋白酶1和胰蛋白酶5條基因mRNA表達量的變化情況，同時檢驗了這5條基因在短期鹽度變化時(30→2/24h)mRNA表達量的變化情況。結果表明，反向文庫中血藍蛋白、幾丁質酶、蛻皮類固醇調節(jié)蛋白、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶1基因轉錄水平下調表達驗證了消減文庫的構建是成功的。這5條基因m

7、RNA表達量在脅迫24小時和56天后表達量變化明顯不同，說明凡納濱對蝦對長期和短期鹽度脅迫可能采取不同的應答策略，以上結果豐富了甲殼動物環(huán)境脅迫研究的基因信息。
　　 3.在長期鹽度脅迫抑制性消減雜交文庫構建的基礎上，探討了長期不同鹽度養(yǎng)殖對凡納濱對蝦(平均體重0.27±0.01 g)生長性能和脅迫響應相關基因(血藍蛋白、幾丁質酶、蛻皮類固醇調節(jié)蛋白、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶1)轉錄水平的影響，以期從分子機理上了解凡納濱對蝦長期低

8、鹽養(yǎng)殖生長性能和生理狀態(tài)的關系。結果表明，降低鹽度到一定程度可顯著降低凡納濱對蝦的生長性能和成活率；不同的基因存在不同的鹽度誘導范圍；相對于海水對照組，血藍蛋白和胰凝乳蛋白酶1轉錄水平與鹽度呈正相關，因此，以上幾種基因轉錄水平反映長期鹽度脅迫的強度。
　　 4.本文利用SSH和RACE(Rapid amplification of cDNA ends，RACE)技術，克隆了凡納濱對蝦兒茶酚-氧位-甲基轉移酶(Catechol-O

9、-methyltransferase，COMT，E.C.2.1.1.6)基因。該基因(LvCOMT)cDNA全長910bp(GenBank登錄號：JQ345478)，編碼221個氨基酸，理論分子量74.9kDa，等電點4.98。經軟件分析該成熟肽有12個磷酸化的氨基酸位點，不具信號肽，推測凡納濱對蝦COMT基因可能是依賴12個可能的氨基酸發(fā)生可逆的的磷酸化反應來進行調控作用的。LvCOMT基因與斑節(jié)對蝦和中國明對蝦的氧位-甲基轉移酶具有

10、高度的相似性，系統(tǒng)進化分析表明，LvCOMT在親緣關系上更接近于哺乳動物的兒茶酚-氧位-甲基轉移酶。應用RQ-PCR分析COMT在凡納濱對蝦中的組織特異性分布，結果顯示COMT在肝胰腺組織中表達量最高，在鰓中的表達量最低。
　　 5.克隆了凡納濱對蝦對鹽度脅迫應答的重要伴侶蛋白基因-鈣網蛋白(calreticulin，CRT)基因(GenBank登錄號：JQ682618)。LvCRT基因cDNA全長1866bp，編碼406個氨基