凡納濱對蝦與WSSV侵染相關的細胞與基因功能分析.pdf

1、對蝦白斑綜合征病毒(WSSV)自20世紀90年代出現后,成為對蝦暴發(fā)性流行病的主要病毒性病原,給水產養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經濟損失。
　　WSSV是一種有囊膜病毒,其感染宿主細胞的第一步是囊膜與靶細胞膜的吸附,而后融合或者內吞進入細胞,完成對細胞的侵染,現已有多個蛋白被報道參與感染,但該病毒感染的分子機制尚不清晰,也沒有有效的防治手段。本論文圍繞解析WSSV感染宿主的分子機制為主要研究目的,分別從WSSV多個囊膜蛋白和凡納濱對蝦重要造血

2、功能相關的轉錄因子Runt基因入手。通過熒光顯微鏡觀察WSSV各囊膜蛋白是否能引起宿主細胞的內吞作用。并使用熒光微球技術,通過已知的受體蛋白對WSSV囊膜蛋白的細胞內吞抑制實驗,進一步驗證與WSSV感染相關的各蛋白之間的相互作用關系。同時研究凡納濱對蝦轉錄因子Runt在受到外界病原侵入后的表達變化,以及重組蛋白注入對蝦體內對感染WSSV病毒后的相對保護情況。通過本論文的研究,以期為闡明WSSV的侵染機制及途徑奠定基礎。
　　本論文

3、的主要研究內容包括以下五個部分:
　　1、WSSV囊膜蛋白介導細胞內吞實驗:FITC標記的重組WSSV囊膜蛋白VP24,VP26, VP28,VP31和VP37介導凡納濱對蝦不同組織細胞的內吞作用鑒定。原代培養(yǎng)凡納濱對蝦的血淋巴,淋巴器官,上皮組織和造血組織細胞,在體外遷出后,和FITC標記的重組囊膜蛋白孵育,通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現,可以使血細胞發(fā)生內吞作用的有VP24,VP28,VP31和VP37;可以使淋巴器官細胞發(fā)生內吞作用

4、的有VP28和VP37;可以使甲殼下表皮細胞發(fā)生內吞作用的有VP28,VP31和VP37;使造血組織細胞發(fā)生內吞作用的有VP24,VP28和VP37。綜上所述,VP28和VP37均能單獨介導宿主細胞發(fā)生內吞作用,在WSSV的侵染過程中發(fā)揮首要的入胞作用。
　　2、應用熒光微球技術研究凡納濱對蝦血淋巴細胞與偶聯熒光微球的重組 WSSV囊膜蛋白的相互作用,并探究AK,Rab7和BP53以及多克隆抗體對VP31,VP28和VP37進入細

5、胞的影響作用。運用EDC法偶聯熒光微球和重組囊膜蛋白,通過流式細胞術檢測,結果顯示BP53對VP37進入血細胞有抑制作用,而Rab7和AK對VP28和VP31進入血細胞沒有起到抑制作用。VP28和VP37的多克隆抗體對VP28,VP37進入細胞有明顯抑制作用,而對VP31抗體對VP31進入細胞沒有抑制作用。說明血細胞對囊膜蛋白VP31的內吞存在非特異性。通過實驗結果,我們可以推論,BP53作為VP37的受體在病毒侵染細胞過程中發(fā)揮重要作

6、用,而Rab7可能作為一種細胞因子,與VP28相互結合參與信號轉導并調節(jié)感染過程。
　　3、凡納濱對蝦Runt轉錄因子cDNA全長序列克隆:應用反轉錄和cDNA末端快速擴增(RACE)技術,首次在凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)中克隆并測序了一種Runt(lvrunt)基因全長。lvrunt cDNA全長1754bp,含有1個663bp長的開放閱讀框,編碼221個氨基酸,理論分子量為23.6 kDa,具有Ru

7、nt-family結構域。對該基因的蛋白序列分析顯示,Lvrunt的氨基酸序列與軟尾太平喇蛄(Pacifastacus leniusculus)相似度為88.1％,與其它種類的氨基酸序列相似性在30%—52.4%范圍內,該蛋白表現較高的種間保守性。
　　4、lvrunt在凡納濱對蝦的組織表達特異性分析及注射對蝦造血激素(LvAST)和WSSV對其轉錄表達的影響:對凡納濱對蝦鰓、腸、肝胰腺、類淋巴、心臟、肌肉組織和血淋巴lvrunt

8、的轉錄特征進行分析,結果顯示該基因幾乎特異性地在血淋巴細胞中表達,而在其它組織中表達較低。肌肉注射重組蛋白 rLvAST6h后,或白斑綜合征病毒(WSSV)粗提液12h后均觀察到lvrunt轉錄表達水平顯著提高。
　　5、凡納濱對蝦Runt的原核表達及其對WSSV感染的體外中和實驗:構建重組表達載體pBAD/gIIIA-lvrunt,轉化到大腸桿菌E.coli內,加入0.02%L-阿拉伯糖于37℃誘導表達,通過SDS-PAGE和對