羊痘病毒(GTPV)高效表達載體的構建及其鑒定.pdf

1、目的：山羊痘病毒（GTPV)為痘病毒科,羊痘病毒屬的一個成員,基因組呈線性,全長約150 kb ,編碼147個開放閱讀框，是牛、羊等重大傳染病重組活疫苗的理想載體。由于插入的外源基因表達量低--啟動子轉錄活性低，本研究旨于構建一個能夠高效表達外源基因的山羊痘病毒（GTPV）表達載體。方法：預測GTPV基因組中早期轉錄因子VETF-l和中期轉錄因子VITF-3基因序列之間56 bp的一段序列為一雙向啟動子，兩個方向分別命名為Pb56(-)

2、，Pb56(+)。通過PCR技術將該啟動子的兩個方向分別與綠色熒光蛋白（EGFP）報告基因融合，構建轉移載體，分別命名為Puc-TK12-Pb56(+)-EGFP,Puc-TK12-Pb56(-)-EGFP。用脂質體轉染法將2個轉移載體以及陰性對照轉移載體Puc-TK12-EGFP，標準載體Puc-TK12-P7.5-EGFP分別與GTPV共轉染至BHK細胞；采用EGFP報告基因系統(tǒng)通過熒光共聚焦顯微鏡，流式細胞儀，熒光實時定量PCR等

3、技術鑒定雙向啟動子并對其活性進行了定量的測定。將布魯氏菌的外膜蛋白蛋白基因omp25作為外源基因插入到驗證好的雙向啟動子后，構建載體命名為Puc119-TK-Pb56(-)-omp25，通過Western-blotting對外源基因的表達活性進行驗證。結果：該基因序列的兩個方向均能啟動EGFP的表達，初步證實了該基因序列為一GTPV的雙向啟動子；Pb56(-)，Pb56(+)的轉錄活性均高于痘苗病毒（VV）的P7.5啟動子；外源基因om