共表達AsiaⅠ型FMDV P1-2A和3C基因重組山羊痘病毒的構建及鑒定.pdf

1、本文以山羊痘病毒為載體，利用病毒在細胞內的同源重組，以綠色熒光蛋白為篩選標記，探索FMDV P1-2A、3C在細胞中的表達，使得進一步預測它們的生物學特征、應用前景及構建更多的表達外源基因的重組GPV變得實際可行。主要的工作進行如下： 1．目的基因的獲得：提取山羊痘病毒溫度敏感弱毒株(YD)DNA為模板，設計特異性引物并進行PCR擴增，獲得了2078bp的DNA片段，并將PCR產物克隆至pGEM-Teasy載體。酶切鑒定、PCR

2、鑒定和測序結果表明，成功獲得了TK基因，獲得的TK基因內存在一個Kpn I酶切位點和編碼區(qū)的早期轉錄終止信號TTTTTN(T)T。核苷酸和氨基酸同源性分析表明，弱毒毒株YDTK基因與參考毒株的核苷酸和氨基酸的同源性在95.5％-100.0％之間，說明羊痘病毒TK基因具有高度的保守性。 2．轉移載體的構建：為了在重組GPV中真實高效地表達外源基因，將口蹄疫病毒(FMDV)衣殼蛋白前體P1-2A基因和蛋白酶3C基因與啟動綠色熒光蛋白

3、雙向串連痘苗病毒啟動子相連，為進一步構建用于轉染的轉移質粒載體提供了包含真核基因表達元件和篩選標記基因的表達盒。以kpn， I為插入位點，將整體表達盒插入山羊痘病毒轉移載體骨架pUC119-TK之中，構建共表達重組山羊痘病毒轉移載體pTK-P7.5-GFP-P。 3．重組山羊痘病毒的篩選和鑒定：在構建表達Asia I型FMDV P1-2A和3C基因和含有綠色熒光蛋白基因的重組山羊痘病毒轉移載體pTK-P7.5-GFP-P的基礎上