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1、 分類號 S858.23 學校代碼 10129 U D C 590 學 號 2009201087 IBRV 熒光定量 PCR 檢測方法的建立及其對單核巨噬細胞表達 IL-2和 IFN-γ的影響 Establishment of IBRV Real Time PCR Detection

2、Method and The Influence to Mononuclear Macrophages Express IL-2 and IFN-γ 論文提交日期：二〇一二年五月 申 請 人：孫志明 學科門類：農(nóng) 學 學科專業(yè)：預防獸醫(yī)學 研究方向：獸醫(yī)公共衛(wèi)生 指導教師：周偉光 副教授 摘 要 牛傳染性鼻氣管炎病毒(Infectious Bovine Rhinotracheitis virus , IBRV) 能引

3、起牛多系統(tǒng)感染，是導致養(yǎng)牛業(yè)巨大經(jīng)濟損失的重要病原之一。本試驗根據(jù) IBRV的 gE 基因保守序列，設計并合成了一對特異性引物，應用該對引物分別建立了常規(guī)PCR 及熒光定量 PCR 檢測方法， 并對模擬臨床樣品進行了檢測。 本試驗又根據(jù)牛 IL-2、IFN-γ及β-actin 基因設計合成了三對引物，建立了實時熒光定量 PCR 的標準曲線以及直線回歸方程， 并對牛單核巨噬細胞體外感染 IBRV 后， 不同時間段 0h、 6h、 12h、

4、24h、48h 表達 IL-2、IFN-γ及β-actin mRNA 的水平進行了分析。以上兩部分試驗結果顯示： （1）常規(guī) PCR 和熒光定量 PCR 檢測 IBRV gE 基因的特異性較好。應用建立的兩種方法擴增從 IBRV、牛病毒性腹瀉病毒、牛輪狀病毒、MDBK 細胞和 IBRV 陰性牛血清提取的核酸，僅 IBRV 擴增出了特異的片段和曲線。 （2）常規(guī) PCR 和熒光定量 PCR 檢測 IBRV gE 基因的靈敏性較高。常規(guī) P

5、CR 的靈敏性為 7×103拷貝/μl，而熒光定量 PCR 方法的靈敏度達到了 70 拷貝/μl，比常規(guī)PCR 方法高 100 倍。 （3）應用兩種方法分別對模擬臨床樣品進行檢測，常規(guī) PCR 方法檢測到的病毒含量為 3TCID50/反應、而熒光定量 PCR 方法檢測到的是 0.03TCID50/反應。 （4）IBRV 體外感染牛單核巨噬細胞后可以顯著降低 IL-2 和 IFN-γ轉錄水平（P<0.05） 。 利用同一對

6、引物建立常規(guī) PCR 及熒光定量 PCR。將兩種 PCR 有機的結合在一起使用，對 PCR 檢測 IBRV 具有潛在的利用價值。同時，建立能夠區(qū)分野生毒株與疫苗株感染的 PCR 檢測方法。通過對比 IBRV 感染單核巨噬細胞后，細胞因子 IL-2、IFN-γ表達水平的動態(tài)變化，分析 IBRV 在影響單核巨噬細胞免疫學功能中的作用地位，為進一步闡明 IBRV 的致病機理奠定基礎。 關鍵詞：IBRV；單核巨噬細胞；細胞因子；熒光定量 PCR