四種淡水魚類組蛋白H2B及其衍生抗菌肽HLP-1的基因克隆、特征分析和原核表達.pdf

1、水生動物病害的防治問題一直是人們關注的重點，但目前很少有特效的藥物能對抗水生動物病害，抗菌肽的出現(xiàn)給此類問題帶來了新的突破。組蛋白H2B及其衍生的抗菌肽HLPs在魚類免疫、抗菌方面的研究已越來越被人們關注，此類研究在對水生動物自身免疫及疾病防治方面具有廣闊的應用前景，本研究旨在對組蛋白H2B及其衍生的抗菌肽HLP一1的序列特征進行分析，為進一步從分子水平上闡明組蛋白H2B及其衍生的抗菌肽HLP-1的來源及抑菌機制奠定基礎，另外，原核誘導

2、表達的研究也對抗菌肽的生產提供了參考，為組蛋白類抗菌肽的抑菌活性研究及較高抗菌活性的抗菌肽篩選提供了研究基礎。
　　本研究根據(jù)GenBanK中的斑馬魚(Danio rerio)等魚類H2B基因保守性序列設計引物，從鳙魚(Aristichthys nobilis)、草魚(Ctenopharyngodon idellus)、鯉魚(Cyprinuscarpio)、鯽魚(Carassius auratus)四種魚肌肉中擴增出組蛋白H2B基

3、因(全長375bp)，并分別構建了不同魚類組蛋白H2B基因的質粒載體，克隆載體，獲得組蛋白H2B基因序列。利用DNAMAN軟件進行了核酸序列相似性比對，結果顯示其同源性高達90％以上。通過在線分析軟件分析了其編碼的不同蛋白質的等電點、分子量、二級結構和三級結構等相關分析。結果顯示：H2B編碼的蛋白質分子量在10 KDa到15 KDa之間：二級結構預測顯示，組蛋白H2B主要由α螺旋和無規(guī)卷曲結構組成；三級結構預測顯示組蛋白H2B含有豐富的

4、α螺旋結構，含量在50％以上。
　　本實驗通過目的基因及載體PET-32a(+)的雙酶切構建了表達載體，并成功轉化至大腸桿菌BL-21(DE3)感受態(tài)細胞中，經IPTG誘導，通過SDS-PAGE電泳，結果表明鯽魚、鯉魚H2B基因在原核細胞大腸桿菌BL-21(DE3)中成功表達。
　　基于鳙魚、草魚、鯉魚和鯽魚H2B基因，設計引物，擴增組蛋白H2B衍生的抗菌肽HLP-1基因，通過相關在線網(wǎng)站及相關軟件對推導的抗菌肽HLP-1進

5、行了蛋白質基本特性分析，結果顯示：分子量在2 KDa左右，含大量陽離子，帶正電性；二級結構顯示其蛋白由無規(guī)卷曲和α螺旋結構組成；三級結構顯示抗菌肽HLP-1位于組蛋白H2B的氨基端。
　　進行目的基因和載體PET-32a(+)的雙酶切，然后連接，成功轉入感受態(tài)細胞BL-21(DE3)中，經IPTG誘導，通過SDS-PAGE電泳檢測，表明了草魚HLP-1基因成功進行了原核表達。
　　本研究成功克隆了組蛋白H2B基因及其衍生的抗