家蠶眠性主基因(M)的精細定位及候選基因的表達分析.pdf

1、就眠蛻皮是家蠶幼蟲的一種重要生理現象,家蠶眠性性狀主要受第6連鎖群上的眠性主基因M控制,此外還受到許多修飾基因及環(huán)境條件的影響。本研究應用高分辨率熔解分析(HRM)技術篩選具有多態(tài)性的SSR標記,進行眠性主基因的定位,進而應用RACE技術克隆候選基因,并對候選基因的表達進行檢測,以期找出控制家蠶眠性的主基因。
　　本研究取得的主要進展如下:
　　(1)HRM技術用于家蠶SSR分子標記基因型鑒定可行性
　　理論上HRM技

2、術可以鑒定單個堿基的基因型多態(tài)性,為了優(yōu)化和確定適合于家蠶基因組SSR分子標記的HRM分析的技術參數,并驗證熔解曲線多態(tài)性產生的機制,我們選擇實驗中出現頻率較高的3種典型熔解曲線多態(tài)性的多態(tài)性標記產物進行回收克隆測序,并進行CLUSTALW比對。
　　結果表明,應用HRM分析技術篩選出的標記多態(tài)性的產生機制多數是序列長度多態(tài)性和單堿基多態(tài)性的綜合作用。研究結果驗證了HRM技術應用于家蠶SSR標記基因型分析的可行性和可靠性。

3、　　(2)家蠶眠性主基因M的定位
　　本研究采用四眠蠶品種大造(p50,+M/+M)與三眠蠶品種C3白(M3/M3)構建BC1M回交群體p50×(C3白×p50),選擇其中的598頭三眠蠶個體作為定位群體,應用高分辨率熔解曲線分析(HRM)技術進行家蠶基因組SSR標記基因型分析,對M基因進行精細定位。通過HRM篩選與M基因連鎖的多態(tài)性SSR標記,繪制出遺傳總距離為2.4cM的精細分子標記連鎖圖,標記S2853-2527和S2853

4、-2843緊鄰M基因兩側,遺傳距離分別是0.2cM和0.7cM,M基因位于家蠶基因組nscaf2853:2,527,929～2,843,864之間,其間有4個預測基因,都屬于序列特異的DNA結合轉錄因子,推測眠性主基因的作用方式可能與此有關。
　　(3)候選基因3’RACE
　　在M基因的精細定位的基礎上,結合家蠶全基因組數據庫,根據候選基因的預測CDS區(qū)序列設計特異性引物,利用RACE技術快速擴增獲得定位區(qū)間4個候選基因的

5、cDNA3’端序列。
　　針對BGIBMGA006391-TA基因進行3’RACE,在p50品系中得到1個序列(p50_6391),在C3白品系中得到2個序列(C3白_6391-1,C3白_6391-2)。C3白_6391-1是BGIBMGA006391-TA的正確產物,具有完整的3’端。C3白_6391-2序列可能是BGIBMGA006392-TA的產物,具有完整的3’端。
　　針對BGIBMGA006393-TA基因進行

6、3’RACE,在p50品系中得到1個序列(p50_6393),具有完整的3’端,長度為1038bp。
　　針對BGIBMGA006394-TA基因進行3’RACE,在p50品系中得到2個克隆產物(p50_6394-1,p50_6394-2),在C3白品系中得到1個克隆產物(C3白_6394)。p50_6394-1是BGIBMGA006394-TA的正確產物。p50_6394-2基因序列經BC1M回交定位群體HRM分型驗證確認該序列

7、不屬于第6連鎖群。C3白_6394不是BGIBMGA006394-TA,是距離BGIBMGA006394-TA基因約80K的位置上存在的另外1個共有保守序列的同源基因。
　　(4)候選基因的表達分析
　　本研究根據候選基因3’RACE的結果,采用熒光定量RT-PCR技術,對四眠品系p50和三眠品系C3白兩個品系中5個不同基因在幼蟲期不同發(fā)育時期的表達量進行了檢測分析。
　　從各個基因的表達譜的變化與就眠蛻皮、p50與C

8、3白品系間眠性差異的關聯性分析,p50_6391、C3白_6391-1、C3白_6391-2的表達量的變化動態(tài)與幼蟲期的就眠蛻皮及眠性均未能發(fā)現有關聯性,可以認為預測基因BGIBMGA0006391-TA與眠性性狀無關。
　　p50_6393基因的表達模式在三眠蠶的1齡與四眠蠶的1-2齡相似,三眠蠶的2-3齡與四眠蠶的3-4齡相似。四眠蠶品種3-4齡的高表達、三眠蠶品種2-3齡的高表達與終齡的決定似乎有一定的關聯。
　　C3