家蠶Hippo通路主基因BmYki的克隆、表達及功能初探.pdf

1、Hippo通路是近年發(fā)現(xiàn)的一條通過調(diào)控細胞生長、增殖及凋亡等過程從而控制器官大小的重要信號轉(zhuǎn)導通路，該通路在果蠅及哺乳動物中非常保守。轉(zhuǎn)錄共激活因子Yorkie（Yki）是Hippo通路下游的核心成員，Hippo通路主要經(jīng)由Yki調(diào)控下游靶基因進并實現(xiàn)控制器官大小的功能。家蠶是著名的經(jīng)濟昆蟲和鱗翅目模式昆蟲。研究家蠶器官大小調(diào)控相關(guān)信號通路及其關(guān)鍵基因，對于揭示鱗翅目昆蟲的共有生物性狀以及利用基因靶標改造家蠶的生產(chǎn)性能，具有重要理論價值

2、和現(xiàn)實意義。
　　本研究以家蠶Hippo通路下游的轉(zhuǎn)錄共激活因子BmYki為靶標，對其進行克隆以及基因結(jié)構(gòu)、亞細胞定位、時空表達特征等分析，并重點在細胞水平上探究其生物學功能。取得的主要結(jié)果如下：
　　1、BmYki基因的克隆及序列特征分析
　　自家蠶中鑒定并克隆了BmYki基因的CDS序列，其中從二化性大造品系中克隆了3種剪接形式BmYki-S1、BmYki-S2和BmYki-S3，從多化性黃血品系中克隆了4種剪接形

3、式BmYki-S1、BmYki-S2、BmYki-S3和BmYki-S4。這是迄今為止首次發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄共激活因子Yki存在多種選擇性剪接形式。
　　2、BmYki基因的亞細胞定位分析
　　選取BmYki-S1和BmYki-S2兩種剪接形式，構(gòu)建了BmYki-S1和BmYki-S2分別與 EGFP融合的亞細胞定位表達載體，轉(zhuǎn)染家蠶卵巢細胞株 BmNs并進行DAPI染色和熒光觀察，結(jié)果表明BmYki-S1和BmYki-S2均定位在B

4、mNs的細胞質(zhì)中，這與果蠅及哺乳動物Yki基因的定位結(jié)果類似。
　　3、BmYki基因的組織和發(fā)育時期轉(zhuǎn)錄表達分析
　　利用熒光定量PCR技術(shù)，對BmYki基因在五齡第3天家蠶各主要組織以及一齡1天至化蛾1天等發(fā)育時期的表達特征進行了分析。結(jié)果表明，BmYki基因在檢測的各組織和發(fā)育時期的表達水平較低，其中在后部絲腺和中部絲腺的表達水平相對最高，在精巢、卵巢、氣管、頭部的表達水平相對較高，在脂肪體、血液、馬氏管、前部絲腺中的

5、表達水平相對最低。BmYki基因在五齡3天和化蛾1天各有一個表達峰值，其中五齡3天的峰值最高，其他各發(fā)育時期的表達水平較低。BmYki基因在絲腺以及絲蛋白開始大量合成的五齡第3天表達最為活躍，暗示其可能參與了絲腺或絲蛋白合成調(diào)控。
　　4、BmYki基因的細胞超表達分析
　　利用GAL4/UAS雙元表達系統(tǒng)，在家蠶胚胎細胞株BmE中過表達BmYki基因，然后對11個已知的Hippo通路下游靶基因以及11個絲蛋白合成相關(guān)基因的

6、表達情況進行熒光定量PCR檢測，結(jié)果顯示：下游靶基因Myc、Ras、E2F1、Diap1、Caspase1、Kibra和Ex均有顯著上調(diào)表達；Diap2、Caspase9略有上調(diào)表達；Wg略有下調(diào)表達；CycE和基因無明顯變化；絲蛋白合成相關(guān)基因FibH、P25、Seri1、Seri2、Seri3、SGF1、SGF2和 SGF3出現(xiàn)明顯下調(diào)表達； FibL、Sage和Dimm無明顯變化。上述結(jié)果表明，家蠶BmYki（Hippo通路）具有

7、調(diào)控細胞增殖及凋亡等生物學過程的功能，并參與了絲蛋白合成相關(guān)基因的表達調(diào)控。
　　5、BmYki基因的細胞敲除分析
　　利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，在家蠶胚胎細胞株BmE中進行了BmYki基因敲除，然后對11個已知的Hippo通路下游靶基因以及11個絲蛋白合成相關(guān)基因的表達情況進行熒光定量PCR檢測，結(jié)果顯示：敲除BmYki基因后，下游靶基因Myc、Ras、Diap1、Caspase9、Caspase1、Kibra和Wg