日本對(duì)蝦免疫相關(guān)基因的克隆及功能的初步研究.pdf

1、對(duì)蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)是危害養(yǎng)殖對(duì)蝦的主要病原,也是制約對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的最重要因素。要尋找抵御該病原的有效方法,最基本的入手點(diǎn)之一就是充分了解作為病原宿主的對(duì)蝦的免疫機(jī)制,通過(guò)提高其自身的抗病毒能力,來(lái)達(dá)到從根本上防治WSSV的目的。因此本論文以具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的日本對(duì)蝦(Marsupenaeus japonicus)為對(duì)象,首先構(gòu)建了用于探尋蛋白質(zhì)相互作用及調(diào)控機(jī)制網(wǎng)絡(luò)的酵母雙雜交文庫(kù),這一平臺(tái)為后續(xù)研究蛋白質(zhì)在日本對(duì)蝦抗病毒

2、免疫中的作用奠定了基礎(chǔ)。而后,本論文又對(duì)幾個(gè)與日本對(duì)蝦天然免疫密切相關(guān)的基因展開(kāi)初步的研究,為建立有效的對(duì)蝦病害防治方法提供科學(xué)依據(jù)和思路。
　　 本論文以日本對(duì)蝦血細(xì)胞和肝胰腺組織混合mRNA為模版,利用SMART技術(shù)和酵母體內(nèi)同源重組的方法構(gòu)建酵母雙雜交文庫(kù),并以日本對(duì)蝦翻譯調(diào)控腫瘤蛋白TCTP為誘餌蛋白對(duì)文庫(kù)進(jìn)行初步篩選。文庫(kù)dsDNA條帶最大可達(dá)5kb。文庫(kù)轉(zhuǎn)化效率為4.8×105轉(zhuǎn)化子/ug pGADT7-Rec,文庫(kù)

3、容量為1.4×106克隆子/ml,重組率大于90％。初篩結(jié)果驗(yàn)證了我們所構(gòu)建的日本對(duì)蝦酵母雙雜交文庫(kù)有效、可靠。
　　 本論文通過(guò)巢式PCR及RACE等方法獲得了日本對(duì)蝦的兩種絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)基因——ERK1/2和p38。根據(jù)人們?cè)谄渌锓N中的研究報(bào)道,這是兩種在各項(xiàng)細(xì)胞活動(dòng)包括抗病毒免疫中具有極為重要地位的基因。通過(guò)對(duì)兩種基因的序列分析發(fā)現(xiàn),日本對(duì)蝦的ERK1/2和p38具備與其他物種中的這兩種基因同樣的基本特征

4、和功能結(jié)構(gòu)域。而且通過(guò)Western blot檢測(cè)后發(fā)現(xiàn),日本對(duì)蝦的ERK1/2蛋白在WSSV病毒感染后磷酸化水平即活性上調(diào),且該現(xiàn)象發(fā)生在病毒感染早期,說(shuō)明在日本對(duì)蝦中,ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以被WSSV所激活,且可能是被病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞這一過(guò)程所誘導(dǎo)。然而,在本研究中,我們還發(fā)現(xiàn)日本對(duì)蝦的ERK1/2和p38蛋白與其他物種之間的不同之處。首先,日本對(duì)蝦的ERK1/2蛋白在Western blot檢測(cè)時(shí)只顯示出一種分子量大小的條帶

5、,說(shuō)明日本對(duì)蝦的ERK1/2蛋白可能不具有如高等動(dòng)物中的分化。此外,我們克隆到的日本對(duì)蝦p38基因編碼的蛋白質(zhì)同其他物種進(jìn)行比較在C端缺少了近100個(gè)氨基酸,但是該現(xiàn)象是否真實(shí),它發(fā)生的具體因?yàn)檫€需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)確認(rèn)。
　　 本論文中還報(bào)道了日本對(duì)蝦中一個(gè)與WSSV感染相關(guān)的基因——centaurin—α1。由于在早期實(shí)驗(yàn)中,我們已經(jīng)獲得了該基因的部分序列,因此,我們首先通過(guò)Real time PCR檢測(cè)了該基因與WSSV感染的

6、關(guān)系。結(jié)果顯示,該基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量隨著病毒感染時(shí)間延長(zhǎng),病毒量增加可以顯著升高,而且這種現(xiàn)象是在病毒感染早期到中期時(shí)出現(xiàn)的,說(shuō)明該基因可以被WSSV感染所誘導(dǎo),且在病毒感染過(guò)程的早中期參與細(xì)胞活動(dòng)。然而,有趣的是,該基因的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量在抗病蝦中相比于普通蝦卻是明顯下調(diào)的,在后者中,centaurin—α1基因的轉(zhuǎn)錄量約為前者的3.6倍。這樣的結(jié)果說(shuō)明,centaurin—α1基因及其編碼的蛋白質(zhì)在日本對(duì)蝦的天然免疫中的作用可能是雙