大腸桿菌不耐熱腸毒素誘導小鼠細胞因子變化規(guī)律研究.pdf

1、大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)是產腸毒素性大腸桿菌(ETEC)產生的一種能導致人或幼畜腸炎和腹瀉的毒性因子。是目前最強有力的粘膜免疫原和粘膜免疫佐劑之一,具有較強的免疫調節(jié)作用,可以刺激機體產生多種細胞因子。但由于其本身具有很強的腸毒性不宜直接使用,因此人們構建了許多無毒或減毒突變體,其中雙突變體LTRG毒性比野生型LT低很多。本實驗利用大腸桿菌表達的重組LT蛋白免疫小鼠或刺激小鼠巨噬細胞,采用建立的熒光定量 PCR方法分析了 LT黏膜佐

2、劑對小鼠體內、及刺激細胞內的6種細胞因子IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6動態(tài)變化。同時采用液相芯片技術及流式細胞技術,分析了LT蛋白作用下巨噬細胞內這6種細胞因子的表達及T淋巴細胞的變化。
　　不同劑量的LTRG蛋白作用體外培養(yǎng)的小鼠巨噬細胞,結果1ug/ml的LTRG蛋白對巨噬細胞的刺激效果最明顯,對IL-1β和IL-4細胞因子變化最顯著。檢測LT蛋白處理的小鼠巨噬細胞中細胞因子的mRNA表達量

3、變化,結果顯示野生型LT組IL-1β、TNF-α和IL-6的mRNA表達量分別在免疫后2h、4h和12h達到峰值,與對照組差異極顯著(p<0.01);IL-12、IFN-γ、IL-4的mRNA表達量在免疫后24h達到最大值,與對照組差異極顯著(p<0.01)。PBS對照組細胞因子無顯著變化。突變型LTRG組細胞因子mRNA的表達量在免疫后達到峰值的時間與野生型LT組相比有不同程度的延遲。
　　為了進一步了解LTRG蛋白對共免疫原的

4、作用,采用LTRG與BSA共免疫小鼠巨噬細胞,結果顯示LTRG和BSA協(xié)同處理后大多數細胞因子的mRNA表達量在12h達到高峰,與單獨使用BSA組差異極顯著(p<0.01);TNF-α和IL-6的mRNA表達量分別在免疫后8h和24h達到峰值,與BSA組差異極顯著(p<0.01)。BSA對照組細胞因子無顯著變化。通過液相芯片技術分析LT對巨噬細胞中細胞因子的影響,由于細胞上清液中蛋白含量比較低,只檢測到TNF-α和IL-6的濃度,結果顯

5、示LTRG蛋白處理后TNF-α和IL-6的濃度分別在36h和48h達到最大值,與PBS對照組差異極顯著(p<0.01);LTRG與BSA共免疫后TNF-α和IL-6的濃度在24h達到最大值,與BSA對照組差異極顯著(p<0.01)。以上結果表明LT可以激活小鼠巨噬細胞炎性反應,執(zhí)行抗原遞呈功能,誘導機體產生體液免疫和細胞免疫應答,并且可以協(xié)同抗原提高免疫效果。
　　LT免疫小鼠實驗中檢測發(fā)現(xiàn),野生型LT和突變型LTRG蛋白組的各細

6、胞因子分別在免疫后48h和60h左右,小鼠脾臟中IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6細胞因子mRNA的表達量達到最大值,與對照組差異極顯著(p<0.01)。PBS對照組細胞因子無顯著變化。表明LT及LTRG蛋白都能通過誘導細胞免疫,刺激高水平細胞因子的轉錄,采用流式細胞術檢測 LT、LTRG蛋白免疫后小鼠脾臟組織中CD4+及CD8+T淋巴細胞的變化。結果顯示,LT和LTRG蛋白免疫小鼠后脾臟中CD4+和CD

7、8+T淋巴細胞比例相比對照組顯著提高。表明,LT、LTRG刺激作用顯著提高了小鼠的T淋巴細胞免疫應答能力。
　　綜上,本研究從轉錄和翻譯水平對LT免疫后細胞、小鼠體內多個細胞因子的變化規(guī)律進行了研究,證明LTRG蛋白能夠誘導Th1、Th2型細胞免疫反應,產生體液免疫和細胞免疫,產生針對 LTRG蛋白抗原的非特異性免疫應答。并能提高共免疫原的免疫效果,促使機體特異性T細胞明顯增多。且LTRG蛋白對Th1、Th2細胞免疫反應的促進作用