豬體細胞克隆胚胎著床前發(fā)育期間H3K27乙?；鼐幊桃?guī)律研究.pdf

1、體細胞克隆技術為創(chuàng)制抗病、產(chǎn)品品質提升、節(jié)糧和環(huán)保等目標性狀改良的轉基因豬育種新材料提供了可能,也有助于拓展以豬為模型,開展人類相關疾病研究,尤其是與轉基因、干細胞等生物技術結合,有望建立豬源生物反應器以生產(chǎn)藥物蛋白、為人類器官移植開辟異源供體以及生物學機理研究等提供革命性的手段。目前克隆效率依然低下,其最根本原因是表觀重編程不徹底。表觀遺傳修飾主要包括DNA甲基化/去甲基化、組蛋白修飾(如乙酰化/去乙?；?、甲基化/去甲基化、SUMO化

2、、磷酸化等)等。其中組蛋白是染色體上核小體的核心,其物理學和化學修飾的變化都會影響相應區(qū)域的基因表達,從而參與調控真核細胞的生長和發(fā)育,但目前對組蛋白修飾,尤其是乙?；揎検欠駞⑴c豬胚胎著床前期發(fā)育的研究極少。故本研究擬以H3K27ac為對象,檢測H3K27ac在體外受精胚(In vitro fertilization embyo,IVFE)、體細胞克隆胚(Nuclear transfer embryo,NTE)以及孤雌激活胚(Part

3、henogenetic activation embryo,PAE)等不同類型豬著床前胚胎不同發(fā)育階段的表達量,進而揭示同一類型胚胎整個著床前發(fā)育階段的動態(tài)變化規(guī)律,通過比較不同類型胚胎的變化趨勢,關聯(lián)胚胎發(fā)育命運,為揭示H3K27ac在豬NTE早期發(fā)育期間的作用機制奠定基礎。
　　試驗一:旨在揭示豬胚胎著床前發(fā)育期間H3K27ac的動態(tài)變化譜。首先,對H3K27ac抗體特異性進行了檢測。用競爭性免疫多肽在豬孤雌囊胚上做驗證,結果

4、顯示沒有H3K27ac信號,表明本文所用抗體H3K27ac是特異性的。我們檢測了H3K27ac在NTE和PAE激活后第15min、30min和1h的表達,根據(jù)NTE的H3K27ac水平,追蹤這一修飾的源頭;進而以IVFE為參照,重點分析了豬NTE在2hpa、6hpa、12hpa、14hpa、16hpa、1cell、2cell、4cell、8cell、morula、EB、EXPB和HB時期的H3K27ac表達水平。結果如下:MII期卵母細

5、胞H3K27ac呈低水平,并一直持續(xù)到卵母細胞孤雌激活后30min,直到1h后H3K27ac水平才有升高的趨勢。核移植供體細胞H3K27ac水平很高,同第15min、30min、1h的NTE的H3K27ac水平相當。在NTE 2hpa、6hpa、12hpa、14hpaH3K27ac表達水平很高,16hpa開始減弱,4cell、8cell降至最低,morula時H3K27ac熒光信號有增強趨勢,直到blastocyst增至最強,這與PAE

6、和IVFE的H3K27ac表達模式相同,不同的是,NTEHB的H3K27ac水平減弱,同PAEHB,而IVFEHB依然維持穩(wěn)定高水平H3K27ac。結果表明,NTE的H3K27ac這一修飾來源于供體細胞,并且4cell、8cell階段H3K27ac的去除可能更有利于胚胎基因組激活。
　　試驗二:目的是探討豬胚胎基因組激活前H3K27ac表達逐漸降低是否依賴于DNA復制、RNA轉錄和蛋白質合成。首先,將孤雌激活后6h的卵母細胞分別經(jīng)

7、3μg.mL-1阿非迪霉素處理12h、25μg.mL-1鵝膏覃堿處理24h、50μg.mL-1放線菌酮處理24h后,再解除抑制,各自在新鮮PZM-3繼續(xù)培養(yǎng)24h、12h、12h,設置對照。結果發(fā)現(xiàn):三個處理組同對照組相比,H3K27ac水平相當且很低,而孤雌激活后6h的卵母細胞H3K27ac水平很高。表明,H3K27ac去除是一個主動的過程。
　　試驗三:為探索H3K27ac乙?；概c去乙酰化酶的動態(tài)變化規(guī)律,我們收集了GV期和

8、MII期卵母細胞各20枚,IVFE、NTE和PAE的1cell、2cell、4cell和blastocyst胚胎各20枚。定量結果顯示:IVFE在1cell、2cell、4cell和blastocyst的HACD1、HACD2、CBP和MBD3要比NTE和PAE同時期胚胎相應基因表達量高。其中,NTE中HACD2表達較高,且在4cell時期NTE的HACD2高于1cell、2cell和blastocyst的NTE的相應基因的表達量。結果

9、表明,這種時空表達差異可以為更多的轉錄翻譯合成組蛋白去乙?；?使4cell、8cell時期H3K27ac能夠有效去除,似乎更利于胚胎基因組激活。
　　試驗四:旨在研究組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA對豬克隆胚胎早期發(fā)育的作用及分子機制。將重構胚經(jīng)50nMTSA處理24h后,去除TSA,PZM-3繼續(xù)培養(yǎng),設置對照,2d、7d后分別觀察并記錄胚胎卵裂與囊胚發(fā)育情況并收集囊胚,免疫熒光。結果:TSA處理組明顯提高了囊胚率(42.5％±2

10、.8%vs.16.0%±3.7%)和總細胞數(shù)(77.4±4.9vs.54.0±7.6),且其處理組囊胚H3K27ac水平比對照組更接近體外受精的水平。表明:TSA能提高克隆囊胚的發(fā)育效率,并改善克隆囊胚H3K27ac水平。
　　綜上所述,本研究首次揭示了組蛋白H3K27ac修飾在豬早期胚胎全基因組表達模式,發(fā)現(xiàn)這種表達模式因豬早期胚胎類型不同而有所差異,且豬胚胎基因組激活前H3K27ac的去除是一個主動的過程,這種主動的去除機制可