石蒜花色苷合成相關(guān)基因的克隆、表達及表達載體的構(gòu)建.pdf

1、石蒜屬植物是廣泛分布于我國的一種優(yōu)良的球根類觀賞植物，現(xiàn)已應(yīng)用于鮮切花、地被綠化、園林景觀配置等方面。本研究以石蒜花瓣為材料，克隆了花色素苷生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因，并對其時空表達模式進行分析，同時構(gòu)建了其中3個基因的植物表達載體，以期為今后研究石蒜花色形成的分子機理以及利用基因工程技術(shù)選育花色新品種奠定基礎(chǔ);主要研究成果如下：
　　 ⑴采用同源克隆結(jié)合RACE技術(shù)的方法，獲得了花色素苷生物合成途徑中LrCHI、LrFLS、L

2、rF3H、LrDFR和LrANS5個結(jié)構(gòu)基因的cDNA全長序列，分別為948 bp、1360 bp、1293 bp、1338 bp和1292 bp，分別編碼236、333、365、364和355個氨基酸。利用NCBI的Blastn和Blastp工具進行比對分析顯示，5個結(jié)構(gòu)基因與其它已知植物的相關(guān)基因均具有較高的同源性。運用生物信息學分析軟件對5個結(jié)構(gòu)基因的分子量、等電點、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、二級結(jié)構(gòu)及保守結(jié)構(gòu)域等進行了分析，同時在多序

3、列比對的基礎(chǔ)上構(gòu)建了其系統(tǒng)進化樹。系統(tǒng)進化樹分析表明，5個基因的系統(tǒng)進化基本符合植物分類學分類，且具有較明顯的種屬特性。
　　 ⑵利用熒光實時定量RT-PCR技術(shù)對石蒜花色素苷生物合成途徑中的關(guān)鍵基因LrCHI、LrFLS、LrF3H、LrDFR和LrANS在不同花發(fā)育時期及不同器官中的表達模式進行了分析。結(jié)果表明，LrCHI和LrDFR在花發(fā)育的前幾個時期表達量較高;LrF3H基因和LrANS基因的表達量都是隨著花的開放逐漸增

4、加，而后隨著花的萎蔫表達量又下降;只有LrFLS基因在凋謝期花瓣中的表達量最高，而在其它時期的表達量相對較低。在不同器官中的表達分析表明LrCHI和LrFLS表達特征相似，即在葉、花葶及花瓣中表達量較高，而在根和鱗莖中表達量相對較低;LrF3H、LrDFR和LrANS基因都是在根、鱗莖和葉中表達量較低，而在花葶和花瓣中表達量相對較高。
　　 ⑶為進一步研究LrF3H、LrDFR和LrANS基因的功能，分別將3個基因連接到含有35