宿根矮化病菌誘導(dǎo)下甘蔗激素含量、超微結(jié)構(gòu)變化及差異表達基因分析.pdf

1、甘蔗是中國乃至世界第一大糖料作物，起源于熱帶及亞熱帶地區(qū)，屬喜溫作物。甘蔗宿根矮化病(Ratoon stunting disease，RSD)是由Leifsonia xyli subsp.xyli(Lxx)引起的，是目前世界所有植蔗地區(qū)危害性極大的病害之一。RSD已經(jīng)成為甘蔗產(chǎn)量的主要限制因素?，F(xiàn)在對RSD的研究主要集中在檢測方法和病原菌的研究，而對RSD病原菌和甘蔗的互作研究較少。本研究從接菌誘導(dǎo)入手，觀察和測定了RSD侵染甘蔗引起的

2、甘蔗產(chǎn)量性狀、蔗糖分、內(nèi)源激素含量以及莖、葉超微結(jié)構(gòu)的變化;構(gòu)建了RSD病原菌誘導(dǎo)的甘蔗莖抑制消減雜交(SSH)文庫;利用qRT-PCR技術(shù)對部分應(yīng)答RSD病原菌誘導(dǎo)的基因差異表達進行驗證;選取5個重要的應(yīng)答RSD病原菌誘導(dǎo)的基因進行克隆和表達分析。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.以新臺糖22號(ROC22)和果蔗(Badila)健康種莖為實驗材料，通過接菌研究發(fā)現(xiàn)，感染RSD種莖的出苗率比對照減少了2.94和8.50個百分點;株

3、高比對照下降16.7和19.4個百分點;莖徑比對照小0.28 cm和0.60 cm;節(jié)間長度比對照減短3.50cm和3.00 cm;單莖重比對照低0.36 kg和1.10 kg;感染RSD植株的蔗糖分低于對照0.9和1.1個百分點（絕對值）;感染RSD處理植株的GA3、IAA含量明顯低于對照和溫湯脫菌處理的，而ABA含量則相反，感染RSD處理的ABA含量明顯高于對照和溫湯脫菌處理的;對照和溫湯脫菌處理激素含量差異不顯著，溫湯脫菌處理可有

4、效地防治甘蔗宿根矮化病;利用透射電鏡技術(shù)對感染RSD植株莖、葉細胞超微結(jié)構(gòu)進行觀察表明，葉片葉肉細胞、維管束鞘細胞及莖細胞內(nèi)的細胞器及細胞核都發(fā)生了明顯的病理變化。與健康葉片相比，葉綠體變形，葉綠體基質(zhì)片層大部分消解，基粒結(jié)構(gòu)消失，葉綠體外膜和內(nèi)膜剝離。線粒體形態(tài)異常，有的腫大、內(nèi)嵴模糊，嚴重者內(nèi)嵴消失并空泡化，僅剩未被消解的殘骸;細胞核形態(tài)變?yōu)椴灰?guī)則，核膜破裂，染色質(zhì)分布不均勻，呈降解狀態(tài)。在感染RSD甘蔗莖維管束導(dǎo)管細胞內(nèi)積累有大量

5、的電子致密物質(zhì)，細胞壁有不同程度的溶解和斷裂，這可能和RSD病原細菌侵染有關(guān)。以上結(jié)果表明，RSD侵染甘蔗后，可能導(dǎo)致光合效率下降，對水分和營養(yǎng)物質(zhì)的運輸能力降低，從而導(dǎo)致甘蔗品質(zhì)和產(chǎn)量的降低。
　　 2.以ROC22健康種莖為實驗材料，構(gòu)建了RSD病原菌誘導(dǎo)的甘蔗莖正向SSH文庫，富集篩選到應(yīng)答RSD相關(guān)差異表達基因195個。通過BLASTN功能比對發(fā)現(xiàn)，195個差異表達基因中，41個屬于抗病與防衛(wèi)反應(yīng)基因，數(shù)量最多，占全部的

6、21％;另外，蛋白質(zhì)合成、降解14個，占7％;新陳代謝17個，占9％;核糖體生物合成12個，占6％;細胞結(jié)構(gòu)10個，占5％;翻譯相關(guān)9個，占5％;轉(zhuǎn)錄調(diào)控18個，占9％;信號傳導(dǎo)12個，占6％;膜轉(zhuǎn)運蛋白8個，占4％;54個為有待驗證的未知功能假定蛋白基因和未分類基因，占全部的28％?；贕O分類標準對所得序列進行分類，結(jié)果表明:參與生物學過程最多的依次為脅迫應(yīng)答、代謝過程和轉(zhuǎn)錄與翻譯，分別占基因總數(shù)的25.1％、17.7％和16.6％

7、。最少的是甲基化作用和糖酵解，均只有0.06％;從分子功能看，最多的是蛋白質(zhì)結(jié)合和核糖體結(jié)構(gòu)組分，分別占15％、11％，最少的是泛素蛋白連接酶活性和鈣離子綁定，只占0.6％;從細胞組分看，組成細胞質(zhì)最多，占36％，其次是細胞核和線粒體結(jié)構(gòu)，分別占15％和13％。最少的是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和轉(zhuǎn)錄阻遏因子，占0.6％。
　　 3、應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)對其中14個應(yīng)答RSD侵染的差異基因進行了表達分析，在RSD誘導(dǎo)下都呈上調(diào)表達。