宿根矮化病菌侵染后甘蔗防御酶活性和蛋白質表達的變化.pdf

1、甘蔗是熱帶和亞熱帶作物,又是典型的C4作物,其進行光合作用的能力遠高于其它作物,也是我國最重要的糖料作物和最具有潛力的能源作物。甘蔗宿根矮化病(RSD)是一種由細菌引起的種苗傳播病害,是甘蔗生產中最為嚴重的細菌病害之一,由于感染RSD的蔗株一般不表現典型的外部癥狀,極易造成病原菌的高度累積和大面積蔓延,造成甘蔗產量和糖分的損失,對宿根蔗的影響尤其嚴重。由于RSD病原菌體外很難分離培養(yǎng),關于RSD病原菌致病性以及與甘蔗互作的研究受到一定程

2、度的限制。本研究從感病的甘蔗體內分離、培養(yǎng)、純化得到RSD病原菌,以此為抗原,制備RSD的多克隆抗體;并利用分離培養(yǎng)的RSD病原菌接種甘蔗,比較感染RSD病菌與健康甘蔗之間的防御酶活性變化,運用蛋白質組學方法比較其蛋白質的差異表達,尋找與RSD病菌脅迫相關的基因,利用同源克隆等技術對這些基因進行克隆和表達分析,結果表明:
　　1、以PCR檢測有陽性條帶的甘蔗為材料,采用改良的SC培養(yǎng)基成功培養(yǎng)出RSD的病原菌Lxx,并分別從形態(tài)學

3、、PCR檢測、rDNA-ITS序列的比對多方面進行證實,確定此次培養(yǎng)的菌落即為RSD的致病菌Lxx,以此進行擴大培養(yǎng),并與福氏完全佐劑混合乳化,皮下多點注射免疫兔子,制備RSD多克隆抗體。用間接ELISA法檢測RSD多克隆抗體的效價,結果表明本研究所制備的RSD多克隆抗體的效價大于1:256000。用組織印記免疫(TBIA)的方法檢測自制的RSD多克隆抗體并比較從美國引進的RSD多克隆抗體,結果兩種不同來源的抗體檢測蔗莖感染RSD的結果

4、一致,說明RSD多克隆抗體已被成功制備。
　　2、以接RSD病菌的甘蔗及健康甘蔗(GT11)為材料,研究RSD病原菌脅迫下甘蔗相關防御酶活性變化。結果表明在RSD病菌脅迫下,莖與葉中CAT、SOD、POD、APX及GR活性均有所提高,但不同防御酶在同一器官及相同的防御酶在不同器官表現均有所不同,在莖中除APX活性一直高于對照外,其它酶活性都表現為在90天時低于對照,180天時都高于對照;在葉中則與此相反,除POD活性一直高于對照外

5、,其它則是在90天時高于對照,180天時都低于對照。這可能是由于RSD病原菌在莖與葉中侵入的時期不同,還有大量定殖時期不同而引起的。
　　3、利用蛋白質雙向電泳技術分析蔗莖在RSD病原菌脅迫下的蛋白質表達情況,發(fā)現40個差異蛋白點,其中有16個蛋白點表現上調,24個蛋白點表現下調,應用MALDI-TOF-TOF/MS串聯(lián)質譜成功鑒定出23個蛋白質。根據功能將其分為6類,其中參與防衛(wèi)反應的占31％、細胞生長和分裂占9%、蛋白修飾與加

6、工占18%、基礎代謝占23%、信號轉導5%、未知功能的占14%,可見甘蔗對RSD病原菌脅迫的應答機制是一個涉及多系統(tǒng)、多水平的綜合過程。
　　4、采用同源克隆的方法克隆得到了4個與RSD病菌侵染相關的cDNA全長:甘蔗類異黃酮還原酶基因(SoIRL)、NADP-異檸檬酸脫氫酶基因(SoNADP-IDH)、乙醇脫氫酶基因(SoADH)及咖啡酸3-O-轉移酶基因(SoCOMT);構建了這4個基因的原核表達載體,并成功導入大腸桿菌,獲得