雞傳染性喉氣管炎病毒gB基因的克隆及表達(dá)的研究.pdf

1、雞傳染性喉氣管是一種遍布世界各地的急性接觸性呼吸道傳染病,由傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)引起,以呼吸困難、咳嗽、常咳出帶血滲出物為發(fā)病特征.ILTV屬于皰疹病毒科α皰疹病毒亞科,目前多用雞傳染性喉氣管炎的弱毒疫苗進(jìn)行預(yù)防,其中大部分弱毒疫苗株具有溫和的致病性,因此可能有毒力返強(qiáng)的危險(xiǎn).近年,ILTV基因組的大部分序列及其功能已經(jīng)確定,這為基因工程疫苗的研制奠定了基礎(chǔ).研究表明ILTV屬于皰疹病毒D型基因組,gB基因編碼205 KD糖蛋

2、白復(fù)合物,能誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫,是該病毒的主要保護(hù)性抗原基因,也是研究基因工程疫苗的首選目的基因,表達(dá)gB糖蛋白是預(yù)防傳染性喉氣管炎的新方法.本論文以疫苗株ILTV基因組為模板擴(kuò)增出gB基因片段連接到載體pGEM-T Vector,對(duì)目的片段gB基因進(jìn)行了序列測(cè)定和同源性分析,與英國(guó)Thorne V882毒株、美國(guó)ILTV632毒株、澳大利亞SA 2毒株gB基因的核苷酸同源性分別為100％、100％和99.4％,氨基酸同源性分別為9

3、9.8％,99.9％和98.7％,說(shuō)明它是十分保守的.然后將gB基因定向克隆于原核表達(dá)載體pBV221中構(gòu)建了重組質(zhì)粒pBV-gB,將其轉(zhuǎn)化到受體菌DH5 α中,菌株DH5 α(pBV-gB)經(jīng)溫控誘導(dǎo)后,SDS-PAGE電泳可見(jiàn)表達(dá)的特異蛋白條帶.ELISA檢測(cè)說(shuō)明gB基因在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物具有很好的反應(yīng)原性,但是雞胚中和試驗(yàn)結(jié)果表明該重組菌株僅能部分中和1個(gè)EID50劑量的北京株ILTV強(qiáng)毒.原核表達(dá)的目的蛋白缺少生物活性和免疫

4、原性,活載體疫苗可以克服這一缺點(diǎn),因此該論文又構(gòu)建了大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒pRR-α-gB,并將其電轉(zhuǎn)化至恥垢分枝桿菌,ELISA檢測(cè)表明重組菌株M.smegmatis mc<'2> 155(pRR-α-gB)的表達(dá)產(chǎn)物具有很好的反應(yīng)原性.Western blot檢測(cè)說(shuō)明ILTV的gB基因在分枝桿菌中獲得了表達(dá)并具有良好的免疫原性.雞胚中和試驗(yàn)結(jié)果表明該重組菌株可以中和1個(gè)EID<,50>劑量的ILTV強(qiáng)毒,能夠保護(hù)SPF雞胚抵