RNA干擾技術調控青光眼術區(qū)纖維化的研究.pdf

1、目的：青光眼是以病理性高眼壓、進行性視神經變性和視野缺損為特征的，位列全球第二位不可逆性致盲眼病。目前青光眼濾過性手術是治療青光眼的最主要手段之一，手術失敗的最主要原因為濾過道的疤痕化，隨著一些抗代謝藥物如5-Fu、MMC等的應用，抗青光眼濾過手術的成功率已大大提高，但隨之帶來一些不可避免的并發(fā)癥：濾過泡滲漏、低眼壓、眼球感染、低壓性眼病等等，嚴重影響了濾過性手術的效果，并進一步加重視功能損害。因此，尋找新的調控術區(qū)疤痕化同時又不影響創(chuàng)

2、口愈合的平衡調控方法是抗青光眼濾過性手術成功的關鍵。 本研究探討應用RNA干擾技術，特異性地抑制IKKB的表達，從而下調NF-κB的活性，降低細胞因子、生長因子的分泌，平衡調控青光眼術區(qū)創(chuàng)口愈合，提高手術的成功率的可行性、安全性、有效性及其作用機制。 方法 1、正常人眼球筋膜成纖維細胞的體外培養(yǎng)和鑒定：取正常供體新鮮的Tenon's囊組織，利用組織塊培養(yǎng)法，進行成纖維細胞體外培養(yǎng)，并利用光鏡、電鏡、細胞免疫組織化

3、學法鑒定人成纖維細胞； 2、設計、合成靶向IKKB基因的siRNAs，并進行篩選得到具有高效干擾效率的siRNA； 3、利用高效的轉染試劑HiperFectTransfectionReagent將siRNA轉入體外培養(yǎng)的人成纖維細胞，并設有不同的轉染濃度(5nM、10nM、25nM、50nM、100nM、200nM)進行RNA干擾，同時設有空白對照組、陰性對照組，然后用RT-PCR的方法檢測干擾后IKKB的mRNA表達水

4、平；用Westernblot的方法檢測IKKB的蛋白表達水平；用MTT法檢測RNA干擾后成纖維細胞增殖能力受到的影響，繪制其量效曲線；采用劃痕法檢測成纖維細胞的遷移能力； 4、采用激光共聚焦熒光顯微鏡檢測RNA干擾后NF-κB的活性，并采用RT-PCR的方法檢測其下游的生長因子：BFGF、CTGF和基質金屬蛋白酶：MMP-2、MMP-9，探討其抑制成纖維細胞增殖的可能機制； 5、利用靈長類動物恒河猴制作青光眼濾過性手術模

5、型，并在手術同時進行siRNA體內轉染術區(qū)筋膜組織，進行動物體內的RNA干擾治療，同時設有MMC對照組、空白對照組。分別于轉染后1d，3d，7d，14d、21d、28d、42d進行眼壓測量，并于術后28d、42d時取標本進行術區(qū)組織病理學切片、Massion三色染色、天狼星紅染色偏振光檢測術后各組的膠原組織增殖情況。 結果 1、體外成功培養(yǎng)正常人眼球筋膜成纖維細胞，細胞呈長梭形，胞漿豐富，核大，生長能力強，呈旋渦樣或羽毛

6、樣生長，Vimentin染色陽性； 2、設計合成的siRNA經篩選獲得1條較為高效的siRNA；體外培養(yǎng)的成纖維細胞經RNA干擾后24小時，RT-PCR檢測顯示：IKKB的mRNA受到了抑制，抑制水平隨著轉染濃度的增大而增大，Westernblot的結果也說明IKKB的蛋白表達也受到了抑制，也具有濃度依賴性。 3、MTT法結果示：靶向RNA干擾抑制IKKB的表達后，體外培養(yǎng)的成纖維細胞的增殖受到限制，轉染濃度為5nM、1

7、0nM、25nM、50nM、100nM、200nM時的抑制率分別為10.7％、23.3％、30.8％、51.2％、50.1％、49.6％；劃痕法檢測也顯示成纖維細胞的遷移能力受到了抑制； 4、激光共聚焦熒光顯微鏡檢測示靶向RNA干擾抑制IKKB后，NF-κB的活性也受到了抑制； 5、RT-PCR檢測結果示：靶向RNA干擾抑制IKKB后，BFGF、CTGF、MMP-2以及MMP-9的表達均受到抑制； 6、在恒河猴濾

8、過性手術模型中，單純手術組的濾過泡存活3周，而RNA干擾組的濾過泡至少可以維持6周，結果與MMC相近似，但是沒有像MMC組那樣產生薄壁濾過泡，也沒有出現過低眼壓；病理組織學檢查發(fā)現單純手術組術后可見結膜下有大量的成纖維細胞增殖，結膜下有大量膠原纖維形成，小血管增生；而RNA干擾組在術后結膜下膠原組織增生較少，明顯比單純手術組稀疏，但是沒有像MMC組那樣稀薄，而且在手術后6周則有少量的纖維組織增殖。 結論 1、RNA干擾技

9、術可以高效地抑制核轉錄因子κB抑制蛋白激酶β(即IKKB)的表達，而且隨著siRNA的轉染濃度的升高而抑制程度增加。 2、靶向RNA干擾抑制IKKB的表達對體外培養(yǎng)的人眼球筋膜囊成纖維細胞的增殖有明顯抑制作用；抑制率隨著siRNA的轉染濃度的增大而增大，當siRNA的轉染濃度為50nM時，達到了體外抑制的最大值。 3、靶向RNA干擾抑制IKKB的表達，能夠抑制體外培養(yǎng)的人眼球筋膜囊成纖維細胞的增殖的機制可能是：由于IKK

10、B受到抑制，因而NF-κB的活性也受到了抑制，進而影響了MMP-2，MMP-9的表達以及BFGF、CTGF等生長因子的表達、分泌。這些生長因子和基質金屬蛋白酶的減少就是成纖維細胞的增殖受到抑制的直接原因。 4、靶向RNA干擾抑制術后IKKB的表達，可以明顯抑制猴眼小梁切除術后濾過區(qū)成纖維細胞的過度增生，抑制術后術區(qū)的炎癥反應，抑制成纖維細胞合成與分泌膠原，從而獲得與MMC的作用相近似的抑制濾過區(qū)疤痕化的效果；沒有明顯的眼內毒性，