線粒體途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在顱內(nèi)動脈瘤生成中的作用機制研究.pdf

1、第一部分:單純血流動力學(xué)誘導(dǎo)的兔基底動脈尖部動脈瘤生成模型建立
　　 目的:建立穩(wěn)定的單純血流動力學(xué)誘導(dǎo)的兔基底動脈尖部動脈瘤生成模型。
　　 方法:12只新西蘭大白兔隨機分為2組，假手術(shù)組（6只）僅暴露雙側(cè)頸動脈而未結(jié)扎，術(shù)后2天組（6只）則結(jié)扎雙側(cè)頸動脈。采用TCD、MRA血管重建及計算機流體動力學(xué)獲得各組動物術(shù)前及術(shù)后2天的基底動脈平均血流速度、基底動脈直徑及基底動脈分叉部各部分平均壁面切應(yīng)力等數(shù)值。所有動物術(shù)后2

2、天處死獲取基底動脈分叉部組織，觀察兩組之間基底動脈尖部內(nèi)彈力層損害、中層薄弱及血管腔外凸樣改變等組織病理變化情況。
　　 結(jié)果:在術(shù)后2天組內(nèi)動物在術(shù)后2天時基底動脈尖部平均壁面切應(yīng)力明顯高于術(shù)前(P=.000);基底動脈直徑術(shù)后2天時較術(shù)前增加，但無統(tǒng)計學(xué)差別(P=.311);基底動脈平均血流速度術(shù)后2天時較術(shù)前明顯提高(P=.003)。而在假手術(shù)組內(nèi)術(shù)后2天時與術(shù)前的上述指標(biāo)相比均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞.05)。在兩組各自組內(nèi)動

3、物術(shù)前及術(shù)后2天時其各自的基底動脈尖部平均壁面切應(yīng)力均明顯高于基底動脈干及左側(cè)、右側(cè)大腦后動脈(P＜.01)。兩組所有動物基底動脈尖部平均壁面切應(yīng)力與其對應(yīng)的基底動脈平均血流速度呈正相關(guān)(R2=0.70，P＜0.0001)。假手術(shù)組動物未發(fā)現(xiàn)基底動脈尖部的內(nèi)彈力層損害、中層薄弱及血管腔外凸樣改變;術(shù)后2天組所有動物基底動脈尖部即壁面切應(yīng)力(WSS)最高區(qū)域均出現(xiàn)內(nèi)彈力層損害，而部分動物(2/6)出現(xiàn)中層薄弱及血管腔外凸樣改變。
　

4、　 結(jié)論:兔雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎術(shù)后2天其最大壁面切應(yīng)力位于基底動脈尖部，且基底動脈尖部平均壁面切應(yīng)力較術(shù)前明顯提高，與其對應(yīng)的基底動脈平均血流速度呈正相關(guān);所有動物結(jié)扎術(shù)后2天基底動脈尖部均有內(nèi)彈力層損害，部分可見到中層薄弱和血管腔外凸等血管破壞性重塑形改變。穩(wěn)定的單純血流動力學(xué)誘導(dǎo)的兔基底動脈尖部動脈瘤生成模型成功建立。通過該模型，可以進(jìn)一步研究單純血流動力學(xué)誘導(dǎo)顱內(nèi)動脈瘤生成的分子機制。
　　 第二部分:線粒體途徑介導(dǎo)的細(xì)胞

5、凋亡在單純血流動力學(xué)誘導(dǎo)的兔基底動脈尖部動脈瘤生成過程中的作用機制研究
　　 目的:在采用雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎的家兔基底動脈尖動脈瘤生成模型基礎(chǔ)上，研究細(xì)胞凋亡參與顱內(nèi)動脈瘤生成的分子機制。
　　 方法:新西蘭大白兔15只，分為3組，假手術(shù)組6只（其中3只用于實時熒光定量PCR分析），雙側(cè)頸動脈結(jié)扎術(shù)后2天組3只，雙側(cè)頸動脈結(jié)扎術(shù)后7天組6只（其中3只用于實時熒光定量PCR分析），獲取動物基底動脈分叉部組織，觀察其內(nèi)彈力層損

6、害、中層薄弱及血管腔外凸樣改變等組織病理變化情況，TUNEL法檢測凋亡細(xì)胞，免疫組化染色及定量分析炎癥細(xì)胞分布及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況，實時熒光定量PCR方法檢測凋亡相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:假手術(shù)組動物均未見內(nèi)彈力層損害及凋亡細(xì)胞，而術(shù)后2天及7天組動物均發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞且主要位于基底動脈尖部即內(nèi)彈力層損害部位，且該部位凋亡細(xì)胞數(shù)量均明顯高于基底動脈干、左側(cè)及右側(cè)大腦后動脈部位，有統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.05)。所有動物血

7、管壁內(nèi)皮層基本保持完整，而炎癥細(xì)胞在血管壁上分布少而散在，且位于外膜層，各組基底動脈尖部即內(nèi)彈力層損害部位與其它部位相比，炎癥細(xì)胞分布均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。術(shù)后7天組動物基底動脈尖部caspase-9及caspase-3mRNA表達(dá)較假手術(shù)組均明顯增高，有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）;而假手術(shù)組與術(shù)后7天組動物基底動脈尖部caspase-8蛋白及mRNA表達(dá)比較均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。在術(shù)后2天及7天組各種凋亡相關(guān)蛋白(

8、caspase-3、caspase-9、Bcl-2、phospho-Bad、Bax、Bid)在基底動脈尖部表達(dá)均明顯高于基底動脈干部、左側(cè)及右側(cè)大腦后動脈，有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。在基底動脈尖部的caspase-3、caspase-9、Bcl-2、Bax、Bid的表達(dá)均在術(shù)后7天組最高，術(shù)后2天組次之，假手術(shù)組最低，有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);而Phospho-Bad的表達(dá)在術(shù)后2天組最高，術(shù)后7天組次之，假手術(shù)組最低，有統(tǒng)計學(xué)

9、差異(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:單純血流動力學(xué)誘導(dǎo)的基底動脈尖部動脈瘤早期生成過程中，血管壁的破壞性重塑形改變并不是由炎癥細(xì)胞浸潤導(dǎo)致，而是來源于管壁本身固有細(xì)胞的作用。細(xì)胞凋亡參與了單純血流動力學(xué)誘導(dǎo)的基底動脈尖部動脈瘤的早期生成，其分子發(fā)生機制是通過caspase-9激活的由Bcl-2介導(dǎo)的線粒體途徑。
　　 第三部分: Ac-DEVD-CHO對兔基底動脈尖部動脈瘤生成的影響
　　 目的:選擇caspas

10、e-3抑制劑Ac-DEVD-CHO作用于單純血流動力學(xué)誘導(dǎo)的基底動脈尖部動脈瘤生成模型，驗證細(xì)胞凋亡在動脈瘤發(fā)生中的作用，確認(rèn)細(xì)胞凋亡是否是顱內(nèi)動脈瘤發(fā)生主要機制。
　　 方法:新西蘭大白兔30只，隨機分為假手術(shù)組、術(shù)后2天組、術(shù)后DMSO2天組、術(shù)后抑制劑2天組、術(shù)后7天組、術(shù)后DMSO7天組、術(shù)后抑制劑7天組、術(shù)后1月組、術(shù)后DMSO1月組、術(shù)后抑制劑1月組，每組3只。觀察雙側(cè)頸動脈結(jié)扎術(shù)后半小時應(yīng)用caspase-3抑制劑

11、Ac-DEVD-CHO能否抑制兔基底動脈尖部caspase-3蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡，能否阻斷或延緩術(shù)后動物基底動脈尖部的組織病理變化進(jìn)程（采用內(nèi)彈力層損害長度、中層薄弱長度及程度、血管腔外凸改變長度及動脈瘤發(fā)展評分進(jìn)行評估）。
　　 結(jié)果:術(shù)后2天組及術(shù)后DMSO2天組均發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞主要位于基底動脈尖部，而術(shù)后抑制2天組基底動脈尖部均未見凋亡細(xì)胞，且術(shù)后抑制2天組基底動脈尖部caspase-3蛋白表達(dá)較術(shù)后2天組及術(shù)后DMSO2天

12、組明顯降低(P＜0.05)。應(yīng)用caspase-3抑制劑、DMSO與未應(yīng)用caspase-3抑制劑時，雙側(cè)頸動脈結(jié)扎術(shù)后動物基底動脈尖部組織病理變化有同樣的隨時間變化趨勢;且在相同時間點應(yīng)用caspase-3抑制劑、DMSO與未應(yīng)用caspase-3抑制劑三種情況相比基底動脈尖部組織病理變化均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。雙側(cè)頸動脈結(jié)扎術(shù)后1月內(nèi)隨著時間延長動脈瘤發(fā)展評分(ADS)逐步升高，有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。